大鼠腦缺血再灌注通過TGF- β1/Smad7通路誘發(fā)急性腎損傷的機制探究

劉云，方錦程，鐘文華，王林，張藝，洪云，李曙

(1.皖南醫(yī)學院 病理生理學教研室，安徽 蕪湖 241001； 2.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)外科，安徽 蕪湖 241001； 3.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院 超聲醫(yī)學科，安徽 蕪湖 241001)

急性腦卒中是臨床上較為常見的腦血管疾病，它可以發(fā)生在機體器官或組織缺血缺氧過程及缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR) 治療后[1]。大量研究證明，腦IR可活化炎癥細胞，促進炎癥介質(zhì)釋放至遠端器官，最終引起全身性炎癥反應[2- 3]，其中腎臟損傷也較為多見。目前已有研究證明導致腦組織IR損傷的機制有白細胞聚集、自由基生成和細胞內(nèi)超載等[4- 5]，但對腎臟組織損傷的機制仍缺乏明確的研究結果，導致臨床在進行治療和藥物干預時缺乏理論支持，所以腦IR引起的急性腎損傷(AKI)仍然是臨床醫(yī)生面臨的一個嚴峻挑戰(zhàn)。造成這種臨床現(xiàn)狀的一個主要原因是缺乏有效的動物模型，因此本研究希望建立一個穩(wěn)定、有效、符合臨床的腦IR損傷誘發(fā)AKI的動物模型，探索其發(fā)生機制，為臨床治療這一類急重并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

選取4～6周齡SPF級健康雄性大鼠，體重240～270 g，由長沙生物天勤有限公司提供，在皖南醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng)。動物實驗經(jīng)安徽省動物倫理委員會批準。尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。轉化生長因子- β1(TGF- β1)、Smad7 抗體購自博奧森(Bioss)生物技術有限公司(北京)。Q- PCR試劑盒購于諾唯贊(Vazyme)生物科技有限公司(南京)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠腦缺血模型 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml·100 g-1)麻醉，仰臥位固定后頸部備皮消毒。沿頸正中部切口，鈍性分離至暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，將血管與周圍的組織鈍性分離，用微血管夾夾閉CCA的近心端。在ECA近交叉部位用絲線打一活結，遠心端打結，之間剪開缺口插入線拴，固定活結，調(diào)整方向插至大腦中動脈分叉處，松除微血管動脈夾，此時大鼠大腦中動脈處于閉塞狀態(tài)。將20只大鼠隨機分為正常組和缺血2、4、6 h組4組各5只。閉塞時間達到實驗所需時間時觀察各組大鼠行為學表現(xiàn)，當大鼠出現(xiàn)跛行、轉圈或偏癱即為模型構建成功。此時將大鼠處死，通過腎功能及病理學觀察選出損傷較為嚴重的時間點作為IR模型中的缺血時間點。之后取25只大鼠構建該缺血模型，并隨機分為再灌注3、6、12、24、48 h 5組。根據(jù)分組時間點取出栓子并處死大鼠。

1.2.2 生化指標及腎臟質(zhì)量指數(shù)檢測 大鼠麻醉后腹主動脈取血，常溫下以3 000 r·min-1離心10 min后獲取血清。檢測血清BUN和Scr水平。大鼠處死后剝離左側腎臟稱取質(zhì)量，腎臟質(zhì)量與處死前大鼠體重之比即為大鼠的腎臟質(zhì)量指數(shù)。

1.2.3 腎臟病理學觀察 大鼠處死后取出腦組織和腎組織，沖洗后用4%多聚甲醛浸泡固定48 h。依次脫水、石蠟包埋，常規(guī)HE染色和Masson染色。HE染色后鏡下觀察腎臟病理改變，Masson染色評估腎臟組織膠原沉積情況。

1.2.4 ELISA法檢測大鼠血漿炎癥因子腫瘤壞死因子- α(TNF- α)和白細胞介素6(IL- 6)水平變化 按照ELISA試劑盒說明書提取大鼠血漿，根據(jù)說明書準備標準品、樣本、抗體和酶試劑，加入樣本和抗體等溫育后洗滌，再依次加入顯色液和終止液，并立即在酶標儀波長450 nm和630 nm處檢測吸光度(OD)值，用標準品的濃度和OD計算出標準曲線方程，再計算樣本濃度。

1.2.5 定量PCR檢測mRNA表達水平 取腎臟組織皮質(zhì)區(qū)加入1 ml Trizol充分裂解，依次加氯仿、異丙醇、75%乙醇提取RNA，逆轉錄后得到cDNA。反應體系為：SYBR 10 μl，無RNA酶水7.2 μl，引物上、下游各 0.4 μl，cDNA 2 μl。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。β- 肌動蛋白(β- actin)為對應內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt計算出目的基因相對表達量。引物序列如下:TGF- β1正向5′- TGCGCTTGCAGAGATTAAAA- 3′,反向5′- AGCCCTGTATTCCGTCTCCT- 3′；Smad7正向5′- CAGATTCCCAACTTCTTCTG- 3′，反向5′- GTTGAAGATGACCTCCAGCC- 3′；膠原蛋白Ⅰ正向5′- AGCACGTCTGGTTTGGAGAG- 3′，反向5′- GACATTAGGCGCAGGAAGGT- 3′；膠原蛋白Ⅲ正向5′- ACGTAAGCACTGGTGGACAG- 3′，反向5′- CAGGAGGGCCATAGCTGAAC- 3′；β- actin正向5′- GCGCAAGTACTCTGTGTGGA- 3′，反向5′- AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG- 3′。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡實驗 常規(guī)提取腎臟組織皮質(zhì)區(qū)總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；同體積的樣本加入十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白后，半干法轉膜；5%脫脂奶粉封閉1.5 h后加入一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h后用ECL法顯色。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 不同缺血時間血清BUN和Scr水平比較及腎臟組織病理學變化

血清BUN和Scr水平正常組在正常范圍內(nèi)，缺血4 h和6 h組較正常組和缺血2 h組顯著升高(P<0.05)，缺血4 h組與缺血6 h組相比差異無統(tǒng)計學意義，見表1；缺血4 h和6 h時腎臟質(zhì)量指數(shù)較其他組顯著下降。上述結果提示，腎臟功能在缺血4 h時開始出現(xiàn)明顯改變。

表1 4組大鼠血清BUN和Scr水平比較 mmol·L-1

大鼠腎臟組織切片HE染色結果：正常組和缺血2 h 組腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小囊整齊緊密排列，腎小管無變形，結構完整；缺血4 h和6 h組可見腎臟腎小球血管袢增生，腎小管輕度水腫擴張，部分區(qū)域結構受損。見圖1。上述結果說明腦組織缺血時間與AKI密切相關，缺血時間越長腎臟損傷相對越重。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結果 染色視野均取自腎組織皮質(zhì)區(qū)。A、B、C、D的上圖為×200，標尺100 μm； 下圖為×400，標尺50 μm

因缺血4 h可見明顯腎臟質(zhì)量指數(shù)和腎功能改變，且HE染色可見明顯病理改變，故選定缺血4 h為本研究缺血時間。

2.2 不同再灌注時間腦組織病理學變化

在缺血4 h基礎上，將再灌注時間點分別設為再灌注3、6、12、24及48 h。腦組織HE染色結果：正常組腦組織結構正常，神經(jīng)細胞排列整齊，胞質(zhì)豐富，核仁清晰可見；缺血/再灌注組損傷側淡染，皮質(zhì)區(qū)膠質(zhì)纖維溶解、呈篩網(wǎng)狀改變，部分缺血邊緣區(qū)可見液化性壞死，局部可見散在的紅細胞和炎癥細胞浸潤。見圖2。上述結果提示腦IR模型構建成功，可進一步行腎臟組織HE染色。

圖2 各組大鼠腦組織HE染色結果 A～G的上圖為整個腦組織視交叉后2～3 mm切片，標尺2.5 mm； 下圖為×200，標尺100 μm

2.3 腦缺血再灌注各時間點腎組織結構變化

腎臟組織HE染色顯示，正常組腎臟組織結構完好。缺血4 h/再灌注3 h、缺血4 h/再灌注6 h及缺血4 h/再灌注12 h組均有輕度損傷。但缺血4 h/再灌注24 h和缺血4 h/再灌注48 h組損傷較重，可見腎臟結構分布錯亂，部分腎臟皮質(zhì)片段呈點片狀壞死，出現(xiàn)小管上皮細胞萎縮，小管管腔擴張，且伴有局部炎癥細胞浸潤。見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟組織HE染色結果 A～G的上圖為腎組織橫切面切片，標尺2.5 mm； 下圖為×200，標尺100 μm

結合上述腦組織及腎組織染色結果，選擇缺血4 h/再灌注24 h作為本次實驗模型的時間點。

2.4 腦缺血再灌注各時間點腎組織纖維化改變

Masson染色結果顯示，正常組形態(tài)正常，結構完整；在缺血4 h/再灌注24 h時可見腎小球周圍及腎小管間質(zhì)有藍色膠原沉積，間質(zhì)纖維組織增生明顯；其余各組與正常組之間無明顯區(qū)別。見圖4。上述結果說明缺血4 h/再灌注24 h可引起腎臟膠原沉積，導致腎臟纖維化。

圖4 各組大鼠腎臟組織膠原、纖維沉積情況 ×200，標尺100 μm

2.5 IR后各時間點炎癥因子水平變化

缺血4 h/再灌注24 h與正常組比較，大鼠血漿炎癥因子TNF- α和IL- 6水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠炎癥因子TNF- α和IL- 6水平比較 mmol·L-1

2.6 腎臟組織TGF- β1、Smad7及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA表達的變化

如圖5所示，與正常組及缺血4 h組相比，缺血4 h/再灌注24 h組TGF- β1及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA表達顯著增加(P<0.05)，而Smad7 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。

a 與正常組比較，P<0.05； b 與正常組比較，P<0.01； c 與缺血4 h組比較，P<0.01

2.7 腎臟組織TGF- β1、Smad7蛋白表達的變化

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結果如圖6所示。與正常組相比，缺血4 h組TGF- β1表達增加(P=0.007)，Smad7

圖6 各組大鼠腎臟組織 TGF- β1、Smad7蛋白表達的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結果

3 討 論

在臨床上可見較多多重器官損傷的病例。機體作為一個整體，一個器官的損傷可以牽動其他器官而產(chǎn)生“綜合征”，如肝腎綜合征、心腎綜合征，此外肺腎綜合征和腦腎綜合征等也有描述[6- 8]。腦IR被認為不僅會造成腦組織損傷，還會引起遠處器官包括腎臟的損傷。有文獻報道AKI是急性卒中后的常見并發(fā)癥，并證明AKI是急性卒中后早期和長期死亡率的獨立預測因子[9]。Khatri等[10]觀察到，急性缺血性卒中會導致腎功能障礙，并且與住院時間延長和死亡率增高有關。AKI因其較高的死亡率、發(fā)病率及昂貴的醫(yī)療費用，成為持續(xù)性臨床問題[11]。AKI可引起腎臟內(nèi)的炎癥反應和細胞凋亡[12]，炎癥是AKI進展的主要因素；急性炎癥反應的特征是炎癥細胞的激活和促炎細胞因子的過度分泌。有研究[13]表明，急性腦損傷可能導致AKI，并引發(fā)腎臟炎癥級聯(lián)反應。

表3 缺血及再灌注對大鼠腎組織中TGF- β1、Smad7蛋白表達的影響

在本研究中，檢測大鼠腦缺血后腎臟功能的指標和HE染色結果表明，大鼠腦缺血4 h時可見血BUN、Scr明顯升高，HE染色見腎小管水腫擴張，并且隨著腦缺血時間延長腎臟損傷不斷加重。明確缺血時間后，通過HE染色篩選不同再灌注時間點大鼠腎臟的病理改變，可見在缺血4 h/再灌注24 h時出現(xiàn)腎臟組織局部炎癥浸潤，部分皮質(zhì)片段呈片狀壞死。為了探究腦IR后大鼠腎功能出現(xiàn)損傷的機制，進一步行腎組織的Masson染色，可見在缺血4 h/再灌注24 h時即可出現(xiàn)腎臟皮質(zhì)區(qū)膠原沉積，考慮因腎臟纖維化導致，于是檢測經(jīng)典纖維化通路TGF- β1/Smad7相關因子的分子水平改變[14]。炎癥細胞的活化聚集、細胞外基質(zhì)的合成與沉積，二者共同促進了腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉化(EMT)改變[15]。Smad7蛋白是TGF- β1受體的胞內(nèi)激酶底物，是該信號通路的重要介導物質(zhì)。大量實驗證明Smad7作為內(nèi)源性TGF- β1拮抗劑，可競爭結合TGF- β1受體。此外，Smad7還可誘導TGF- β受體1的泛素- 蛋白酶體降解，從而對TGF- β1/Smad7通路產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)作用[16]。在本研究中，TGF- β1在腦組織IR的動物模型中呈高表達，而其負性調(diào)節(jié)蛋白Smad7在模型中表達降低；與對照組相比，在腦IR組的腎臟切片中發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤增加，且伴有膠原纖維沉積。關于TGF- β1/Smad7 通路激活的原因目前少有報道，檢測大鼠腦組織IR后血漿中促炎因子表達，可見呈明顯的表達上升趨勢，也驗證了腦IR后對全身炎癥反應系統(tǒng)的激活，從而造成遠端臟器的損傷[17]。在今后研究中，可針對TGF- β1這一靶點進行調(diào)節(jié)，有望改善腦IR引起腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，大鼠腦缺血4 h/再灌注24 h時，腎臟組織中TGF- β1/Smad7通路激活，TGF- β1表達明顯上升，Smad7表達明顯下降，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ表達明顯上升，且腎臟組織染色中可見明顯膠原沉積現(xiàn)象，出現(xiàn)腎臟纖維化改變。在后續(xù)的研究中可通過調(diào)節(jié)這一通路以減少炎癥細胞浸潤、減輕氧化應激對腎臟造成的損傷，從而改善腎臟受損。本研究為腦IR損傷誘發(fā)AKI等相關疾病的臨床研究提供了實驗基礎。