安石榴甙對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制研究

蘇乙花，汪云鑫，陳學武

(海南省中醫院 腫瘤科，海南 海口 570203)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒童和青少年最常見的惡性腫瘤，嚴重影響患者的生命健康。OS容易發生轉移，轉移性OS患者的5年生存率不足20%[1]。雖然近年來化療技術不斷提高，但是患者的總體生存率未見明顯提高，仍有27%的接受化療患者3年內出現局部復發[2]。另外化療藥物的毒副作用也嚴重影響了患者的生活質量，因此亟需尋找新的治療策略。安石榴苷(punicalagin，PUN)是石榴皮多酚中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗菌等作用[3]。PUN抗腫瘤活性的作用近年來逐漸受到重視。有研究發現，PUN可能通過影響細胞增殖、凋亡、自噬和細胞周期等抑制宮頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌和結直腸癌等的進展[4- 6]。PUN對OS的作用及其機制既往少有報道。分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，在腫瘤細胞增殖和遷移中起重要作用[7]。在OS中，分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白信號通路與瘤細胞上皮間質轉化(mesenchymal transition，EMT)密切相關[8]。本研究檢測PUN對骨肉瘤U2OS和MG63細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并分析PUN對分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路和EMT的影響，旨在為PUN在OS治療中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

骨肉瘤U2OS和MG63細胞購于中國科學院上海細胞庫。PUN購于草源康生物有限公司。主要試劑：RPMI 1640培養基、DMEM培養基、青霉素、鏈霉素和0.25%胰蛋白酶均購于上海捷瑞生物工程有限公司，結晶紫染色液購于北京索萊寶科技有限公司，Matrigel膠購于美國BD公司，蛋白提取試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購于美國Thermo Fisher公司，E鈣黏蛋白、N鈣黏蛋白、波形纖維蛋白、鋅指蛋白轉錄因子(ZEB1、Snial、Twist)、β- 連環蛋白、c- Myc蛋白、細胞周期蛋白D1、內參β- 肌動蛋白(β- actin)抗體均購于美國Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用RPMI 1640培養基培養MG63細胞，DMEM培養基培養U2OS細胞。培養基中加入10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2條件下進行培養。

1.2.2 結晶紫法檢測細胞增殖能力 將瘤細胞以5 000 個·孔-1密度接種于96孔板，用不同濃度PUN處理兩種瘤細胞，分別設置為不加PUN的對照組和50、75、100 μmol·L-1PUN組，每組設5個復孔。分別培養24、48、72 h后取出1板，用PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定10 min。隨后每孔加入200 μl結晶紫染色液，10 min后用蒸餾水清洗，干燥后觀察染色情況。加入200 μl的10%乙酸，脫色20 min，用酶聯免疫檢測儀檢測吸光度值，計算細胞相對增殖率。

1.2.3 細胞劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 將細胞接種于6孔板中，當細胞融合度為90%時，用10 μl移液器無菌槍頭在細胞表面進行劃痕。隨后用含不同濃度PUN的2%血清培養液培養瘤細胞，記為0 h劃痕寬度。觀察和記錄12、24 h時同一位置的細胞劃痕寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%[9]。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞侵襲和遷移 將含有50 000個細胞的200 μl無血清培養基滴入Transwell小室的上室，此為細胞遷移實驗。遷移時間約為12 h，隨后進行侵襲實驗，將50 000個細胞加入上室，涂上無血清培養基稀釋的Matrigel，保持上室培養基中含有質量濃度為IC50的PUN。分別將800 μl含有10%胎牛血清的培養基加入下室。37 ℃條件下進行孵育，將膜底表面的瘤細胞用100%甲醇固定，隨后用0.1%結晶紫染色液進行染色，30 min后在光鏡下進行計數。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平 用RAPI裂解液提取瘤細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，進行10%十二烷基磺酸鈉- 聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗E鈣黏蛋白(1∶500)、抗N鈣黏蛋白(1∶1 000)、抗波形纖維蛋白(1∶200)、抗ZEB1(1∶500)、抗Snial(1∶500)、抗Twist(1∶1 000)、抗β- 連環蛋白(1∶500)、抗c- Myc蛋白(1∶1 000)或抗細胞周期蛋白D1(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入羊抗兔二抗(1∶500)，封閉1 h。以β- actin作為內參，ECL發光儀進行蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統計學處理

應用SPSS 20.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 PUN抑制U2OS和MG63細胞的增殖

用不同濃度PUN分別處理U2OS和MG63細胞，24、48及72 h時用結晶紫染色法檢測細胞增殖能力。不同劑量PUN均可抑制U2OS和MG63細胞的增殖，并且存在劑量依賴性，PUN劑量越大細胞增殖能力越低(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞相對增殖率 %

2.2 PUN抑制U2OS和MG63細胞的遷移

用細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測U2OS和MG63細胞的遷移，結果顯示，不同劑量PUN均可抑制瘤細胞遷移，并且存在劑量依賴性，PUN劑量越大細胞遷移越會被抑制(P<0.05)，見表2、3。

表2 各組細胞劃痕愈合率比較 %

表3 各組遷移細胞數比較 個

2.3 PUN抑制U2OS和MG63細胞的侵襲

Transwell小室實驗檢測U2OS和MG63細胞的侵襲力，結果顯示，不同劑量PUN均可抑制瘤細胞侵襲，并且存在劑量依賴性，PUN劑量越大細胞侵襲越會被抑制(P<0.05)，見表4。

表4 各組侵襲細胞數比較 個

2.4 PUN抑制U2OS和MG63細胞EMT

在U2OS和MG63細胞中，與對照組及50 μmol·L-1PUN組比較，75 μmol·L-1PUN及100 μmol·L-1PUN組N鈣黏蛋白、波形纖維蛋白及ZEB1、Snial、Twist蛋白表達水平較低，而E鈣黏蛋白蛋白表達水平較高(P<0.05)，見表5、6。

表5 U2OS細胞中各組EMT相關指標蛋白相對表達量比較

表6 MG63細胞中各組EMT相關指標蛋白相對表達量比較

2.5 PUN抑制U2OS和MG63細胞分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路

在U2OS和MG63細胞中，與對照組比較，75 μmol·L-1PUN及100 μmol·L-1PUN組β- 連環蛋白、c- Myc蛋白、細胞周期蛋白D1蛋白表達水平較低(P<0.05)，見表7。

表7 U2OS和MG63細胞中各組分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路相關指標蛋白相對表達量比較

3 討 論

OS預后較差，局部和遠處轉移發生早，治療效果不盡如人意[10- 11]。PUN是石榴皮多酚中的主要成分，占60%～70%，極性強，易溶于水，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血脂、抗腫瘤等作用[12- 13]。本研究以骨肉瘤U2OS和MG63細胞為研究對象，發現PUN可以抑制瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并且可抑制分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路和EMT。

PUN的抗腫瘤機制主要有以下幾個方面：(1) 抗炎：PUN可通過抑制轉錄因子κB炎癥信號通路阻滯癌細胞周期，誘導癌細胞凋亡[14]。(2) 促進凋亡和自噬：在結直腸癌的研究中，PUN可以通過調節膜聯蛋白A1表達而促進癌細胞的凋亡和自噬[5]。(3) 誘導DNA損傷：PUN可促進共濟失調毛細血管擴張突變基因編碼蛋白(ATM)的磷酸化，進而誘導癌細胞DNA損傷，誘導細胞死亡[6]。(4) 抑制腫瘤細胞增殖和侵襲：PUN通過多種信號通路直接抑制瘤細胞的增殖和侵襲[14- 15]。

PUN抗OS的作用既往少有報道。本研究用結晶紫法、細胞劃痕愈合實驗、Transwell小室法分別檢測細胞增殖、侵襲和遷移能力，發現50、75、100 μmol·L-1的PUN均可以抑制U2OS和MG63細胞的增殖、侵襲和遷移，并且存在劑量依賴性，劑量越高抑制作用越強。分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路在胚胎發育、組織再生和其他生理過程中起著重要作用，該通路的異常活化可誘導癌癥的發生[7]。既往研究已證實，分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路在OS中存在異常活化，該通路激活后可促進瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[16- 17]。本研究發現，PUN可抑制分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路中關鍵蛋白β- 連環蛋白、c- Myc蛋白、細胞周期蛋白D1的蛋白表達，提示PUN可能通過抑制該通路的激活而抑制OS的發生和發展。

EMT與細胞的轉移及侵襲有關，與癌癥密切相關[18]。既往研究顯示，分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路能調控EMT，參與腫瘤發生與發展[18]。E鈣黏蛋白、波形纖維蛋白、N鈣黏蛋白及ZEB1、Snial、Twist是EMT的標志蛋白[19- 20]。本研究結果顯示，在U2OS和MG63細胞中，與對照組及50 μmol·L-1PUN組比較，75 μmol·L-1PUN及100 μmol·L-1PUN組N鈣黏蛋白、波形纖維蛋白及ZEB1、Snial、Twist蛋白表達水平較低，而EE鈣黏蛋白蛋白表達水平較高，說明PUN可以抑制EMT。

綜上所述，PUN可能通過抑制分泌型糖蛋白/β- 連鎖蛋白通路和EMT而抑制OS瘤細胞的增殖、侵襲、遷移。本研究也存在一些局限性，如：僅選取了U2OS和MG63兩種OS細胞系；未分析PUN對凋亡、細胞周期等的作用；PUN對OS的抑制效果未在體內進行驗證。未來有待開展動物研究，進一步探討PUN對OS的抑制作用及其生物學機制。