窒息新生兒生后一周內(nèi)腸道菌群產(chǎn)氣差異分析

張華婷，尹迪，王雪芳，管坤玉，龔小慧，胡勇

(上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院 新生兒科，上海 200062)

新生兒窒息是指產(chǎn)前、產(chǎn)時、產(chǎn)后多種原因引起的新生兒缺氧缺血，可造成患兒的細胞代謝功能障礙，對其腦、心、肺、腎及消化道等多器官功能產(chǎn)生影響。窒息患兒早期胃腸道供氧供血減少，多有胃腸道功能紊亂癥狀，常表現(xiàn)為腹脹、腸鳴音減弱或消失等喂養(yǎng)不耐受表現(xiàn)，甚至并發(fā)新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎。2017年我國一項多中心研究表明，新生兒窒息尤其是重度窒息患兒多存在不同程度的胃腸功能障礙，且多器官損害發(fā)生率可達40%以上[1]，成為發(fā)展中國家新生兒時期死亡和兒童致殘的主要原因之一[2]，嚴重威脅新生兒健康。

目前普遍認為人類腸道菌群在新生兒甚至胎兒期即開始定植，胎盤、羊水、胎糞等均可檢測到一定數(shù)量的細菌[3- 5]，出生方式、喂養(yǎng)、胎齡以及外界因素可不同程度影響腸道菌群定植[6]。健康的腸道菌群參與構(gòu)建穩(wěn)定的腸道生態(tài)系統(tǒng)，腸道氣體是人體腸道環(huán)境的重要組成部分，主要由腸道菌群分解代謝腸腔內(nèi)碳水化合物產(chǎn)生[7]，共同參與兒童生長過程中營養(yǎng)物質(zhì)代謝、驅(qū)動免疫成熟、維持胃腸功能、影響神經(jīng)內(nèi)分泌及行為等[8]，對嬰兒生長發(fā)育乃至成年后的健康有深遠的影響。

本研究使用國內(nèi)首臺體外發(fā)酵系統(tǒng)與氣體分析儀，收集窒息新生兒和對照組新生兒出生1周內(nèi)的糞便樣本，基于不同底物分別進行體外發(fā)酵，檢測發(fā)酵產(chǎn)物中幾種主要氣體的含量，并基于體外模擬平臺，批量液體培養(yǎng)腸道菌群，同時體外發(fā)酵不同碳水化合物后進行產(chǎn)氣測定，探討腸道產(chǎn)氣在胃腸功能中的臨床意義。基于此，探究窒息新生兒腸道菌群產(chǎn)氣特征，為避免腹脹、新生兒壞死性結(jié)腸炎等狀況的發(fā)生提供理論依據(jù)，為窒息新生兒治療提供參考。

1 對象、材料與方法

1.1 研究對象

選取2020年8月至12月間我院新生兒科收治的窒息新生兒，設(shè)為窒息組，納入標準：(1) 符合中華醫(yī)學(xué)會圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會新生兒復(fù)蘇學(xué)組新生兒窒息診斷標準之一[9]：①Apgar評分1 min≤7分或5 min≤7分，伴臍動脈血pH值<7.2；②未取得臍動脈血氣分析結(jié)果的，Apgar 評分≤7分；(2) 足月兒，出生后24 h內(nèi)入院；(3) 單胎；(4) 患兒母親年齡20～40歲，無特殊飲食習(xí)慣。同時以我院非窒息新生兒作為對照組，納入標準：(1) 出生后24 h內(nèi)入院；(2) 新生兒生后無窒息復(fù)蘇史，無敗血癥等；(3) 單胎；(4) 新生兒母親年齡20～40歲，無特殊飲食習(xí)慣；并在性別、出生方式上與研究組患兒進行匹配。兩組新生兒住院期間以人工喂養(yǎng)為主，兩組研究對象排除標準：(1) 存在先天性消化道畸形；(2) 存在遺傳代謝性疾病；(3) 未同時采集到出生后第1、第7天糞便樣本；(4) 出生后1周內(nèi)有益生菌制劑使用史。

本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查，所有入組新生兒家長均簽署知情同意書，按照“知情同意、自愿參加”原則參與本研究。

1.2 研究材料與方法

1.2.1 標本采集和處理 采用同一規(guī)格無菌糞便收集盒收集入組患兒生后第1、第7天的新鮮糞便，于4～6 h內(nèi)送達實驗室進行處理。采集時用無菌棉簽刮取尿不濕表面的新鮮糞便，盡量避免尿液污染，將新鮮糞便加入?yún)捬趿姿猁}緩沖液(PBS，pH 7.0)配制成質(zhì)量濃度為100 g·L-1的混懸液，混勻后用0.125 mm的無菌金屬篩過濾除去大的食物殘渣待用。

1.2.2 體外培養(yǎng)發(fā)酵 配置體外厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基YCFA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，成分為：胰蛋白胨10 g·L-1；酵母提取物2.5 g·L-1；L- 半胱氨酸1 g·L-1；血紅素2 ml·L-1；NaCl 0.9 g·L-1；CaCl2·6H2O 0.09 g·L-1；KH2PO40.45 g·L-1K2HPO40.45 g·L-1；MgSO4·7H2O 0.09 g·L-1；維生素I 200 μl·L-1；刃天青(1 g·L-1)1 ml。其中維生素I 溶液配方為：生物素0.05 g·L-1，鈷胺素0.05 g·L-1，對氨基苯甲酸0.15 g·L-1，葉酸0.25 g·L-1，吡哆胺0.75 g·L-1。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別以8 g·L-1濃度加入下列4種碳水化合物：低聚果糖(FOS)、母乳低聚糖(FL- 2)、低聚半乳糖(GOS)、乳糖(LAT)，構(gòu)建4種不同碳源培養(yǎng)基。

體外發(fā)酵實驗以批量厭氧發(fā)酵的形式進行。將500 μl處理好的新鮮糞便懸液分別接種到5 ml上述4種培養(yǎng)基中，放置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，采用腸道微生物發(fā)酵氣體分析儀檢測其產(chǎn)氣總量，以及二氧化碳(CO2)、氫氣(H2)、甲烷(CH4)和硫化氫(H2S)4種氣體的含量，并計算其各自的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析

2020年8月至12月間，我院新生兒科室共收治窒息新生兒61例，符合入組標準者35例，其中生后1周內(nèi)死亡/放棄治療1例，住院未滿7 d 8例，未同時收集到生后第1、第7天糞便6例，最終入組20例患兒，設(shè)為窒息組；根據(jù)入組標準及性別、出生方式，匹配20例足月新生兒作為對照組，包括特發(fā)性圍生期感染 10例、新生兒濕肺 4例、新生兒低血糖2例、心動過緩 1例、口腔腫物 1例、新生兒痤瘡 1例、足月小樣兒 1例。兩組新生兒胎齡、出生體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組新生兒一般臨床資料比較

2.2 糞便發(fā)酵后產(chǎn)氣總量

糞懸液發(fā)酵24 h后，兩組4種培養(yǎng)基發(fā)酵液中均有氣體產(chǎn)生。生后第1天窒息組患兒糞便發(fā)酵FL- 2后產(chǎn)氣總量顯著少于發(fā)酵FOS、GOS、LAT 3種底物者，而對照組發(fā)酵不同底物后產(chǎn)氣總量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。生后第7天窒息組患兒糞便發(fā)酵FL- 2后產(chǎn)氣總量顯著少于發(fā)酵FOS、LAT兩種底物，對照組發(fā)酵GOS后產(chǎn)氣總量顯著低于發(fā)酵其他3種底物者。見圖1A、B。兩組間比較顯示，生后第1天窒息組發(fā)酵FOS、GOS后產(chǎn)氣總量顯著高于對照組，生后第7天窒息組發(fā)酵GOS后產(chǎn)氣總量顯著高于對照組，見圖1C、D。

a P<0.05， b P<0.01， c P<0.001

2.3 糞便發(fā)酵后產(chǎn)氣成分分析

2.3.1 不同底物發(fā)酵的氣體成分分析 生后第1天窒息組患兒糞便發(fā)酵FL- 2后產(chǎn)CO2量顯著少于GOS、FOS兩種底物者，產(chǎn)H2量顯著低于FOS、GOS、LAT 3種底物者。生后第7天窒息組患兒糞便發(fā)酵FL- 2后產(chǎn)H2量顯著低于FOS底物者。窒息組發(fā)酵LAT后產(chǎn)CH4量顯著低于發(fā)酵FL- 2后，而產(chǎn)H2S量則顯著高于GOS。見圖2A、B。生后第1天對照組患兒糞便發(fā)酵不同底物后產(chǎn)氣量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，生后第7天糞便發(fā)酵GOS后產(chǎn)H2S量顯著低于發(fā)酵FL- 2后，見圖2C、D。

a P<0.05， b P<0.01， c P<0.001

縱向配對比較顯示，生后第7天窒息組患兒糞便發(fā)酵GOS后產(chǎn)CO2、H2、H2S量均顯著低于生后第1天，而窒息組糞便發(fā)酵LAT后產(chǎn)CH4量顯著低于第1天，見表2。

表2 窒息組新生兒糞便發(fā)酵后產(chǎn)氣情況比較 %

2.3.2 兩組新生兒生后1周內(nèi)糞便產(chǎn)氣成分比較 比較兩組新生兒生后第1天糞便產(chǎn)氣可見，窒息組糞便發(fā)酵FOS、GOS、LAT 3種底物后產(chǎn)CO2量均顯著高于對照組，發(fā)酵4種底物后產(chǎn)CH4量均顯著高于對照組，發(fā)酵FOS后產(chǎn)H2量明顯高于對照組，發(fā)酵LAT后產(chǎn)H2S量明顯高于對照組，見圖3。

a P<0.05， b P<0.01， c P<0.001

生后第7天，窒息組糞便發(fā)酵FOS、GOS、LAT后產(chǎn)CO2量顯著高于對照組，發(fā)酵FL- 2后產(chǎn)CH4量顯著高于對照組，發(fā)酵GOS、LAT后產(chǎn)H2量顯著高于對照組，發(fā)酵LAT后產(chǎn)H2S量顯著高于對照組，見圖4。

a P<0.05，b P<0.01，c P<0.001

3 討 論

腸道內(nèi)一定量的氣體對維持正常腸道功能起重要作用，腸道菌群產(chǎn)氣是腸腔內(nèi)氣體的重要來源，且受不同碳水化合物的影響。LAT是人乳重要成分之一，在消化道內(nèi)的吸收依賴于乳糖酶，由于新生兒結(jié)腸乳糖酶發(fā)育不成熟，LAT多進入結(jié)腸由腸道菌群代謝利用。而FOS、GOS、FL- 2作為人類膳食中常見的低聚糖，幾乎不被消化道前部吸收，經(jīng)結(jié)腸由腸道菌群選擇利用，可促進腸道內(nèi)雙歧桿菌等有益菌增殖，進而調(diào)節(jié)腸黏膜屏障、增加機體免疫力等[10]。FOS、GOS作為益生元普遍應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉中[11]，F(xiàn)L- 2則廣泛存在于人乳中，可促進有益菌定植，改善嬰幼兒早期腸道健康[12]。臨床上胃腸功能障礙、炎癥性腸病以及新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎等患兒病程中都有不同程度的氣腹表現(xiàn)，提示腸腔產(chǎn)氣紊亂。目前關(guān)于新生兒及窒息患兒腸道菌群產(chǎn)生氣體研究不多，本研究結(jié)果顯示，窒息患兒出生后第1天和第7天時，其糞便菌群利用GOS產(chǎn)生氣體的總量均顯著高于對照組，生后第1天的FOS和生后第7天的LAT中氣體總量亦顯著高于對照組，提示窒息新生兒腸道內(nèi)菌群產(chǎn)氣水平顯著高于非窒息新生兒，與臨床上窒息患兒易出現(xiàn)胃腸功能紊亂表現(xiàn)一致。

本研究進一步分析了主要氣體的成分和差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，窒息患兒的糞菌在以FOS、GOS、LAT為底物進行發(fā)酵時，均產(chǎn)生了顯著高于對照組的CO2，僅在以FL- 2為底物時，產(chǎn)生的CO2含量與對照組基本一致，這證實窒息患兒早期適當(dāng)腸外營養(yǎng)的合理性，且腸內(nèi)喂養(yǎng)需提倡純母乳喂養(yǎng)，過早攝入FOS以及GOS可使腸腔內(nèi)CO2產(chǎn)生增加，增加腸腔內(nèi)氣體淤積，破壞患兒腸腔內(nèi)氣體平衡，成為窒息新生兒胃腸功能紊亂的重要影響因素，具體機制仍待進一步研究。

目前研究普遍認為腸道產(chǎn)CH4菌定植與年齡相關(guān)，3歲以前兒童呼出氣內(nèi)未檢測到CH4[13]。一項兒童糞便研究表明，年齡小于27個月兒童糞便中未檢測到產(chǎn)CH4菌，但3歲兒童糞便中40%可檢測到產(chǎn)CH4菌[14]，而成人腸內(nèi)產(chǎn)CH4菌含量相對穩(wěn)定[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組患兒4種培養(yǎng)基中產(chǎn)CH4量占比極低(<0.1%)，提示新生兒腸道內(nèi)可能無產(chǎn)CH4菌定植，這與既往研究相符。但窒息組患兒不同底物發(fā)酵后產(chǎn)CH4量相較對照組顯著升高，占比相對恒定，提示窒息患兒腸道內(nèi)存在產(chǎn)CH4菌可能，可利用腸道內(nèi)H2和CO2產(chǎn)生CH4。研究認為腸道內(nèi)CH4與腸易激綜合征、腸道功能紊亂、慢性便秘等密切相關(guān)[16]，CH4的產(chǎn)生可以消耗腸道內(nèi)H2和CO2而減少氣體體積[17]，此外有研究顯示CH4能減緩腸胃蠕動速度[18]，具體作用機制尚未闡明。窒息患兒早期腸腔內(nèi)CH4的存在對緩解腸道內(nèi)積氣有一定作用，但其對早期胃腸功能的影響尚待進一步研究。

H2對人體生理功能沒有直接作用，常作為其他微生物菌的代謝原料，進一步發(fā)酵產(chǎn)生CH4、H2S等氣體[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在以各種碳源為底物進行發(fā)酵時，窒息組患兒糞菌發(fā)酵產(chǎn)物中的H2含量偏高。1974年Newman[20]發(fā)現(xiàn)志愿者食用低聚糖含量豐富的豆類后呼出氣內(nèi)H2含量增加，并且出現(xiàn)腹部不適，且與H2含量呈正相關(guān)，乳果糖經(jīng)腸道細菌發(fā)酵可產(chǎn)生大量H2[21]，多種證據(jù)證實腸道H2含量與腸道菌群以及不同碳水化合物相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)窒息組患兒生后1周內(nèi)FL- 2培養(yǎng)基中H2含量占比最低，且與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)論可為窒息患兒早期母乳喂養(yǎng)提供新的依據(jù)。

近年來有研究表明H2S是人體氣體信號分子之一，H2S對腸缺氧再灌注損傷大鼠腸黏膜起保護作用[22]。Teague等[23]研究表明，H2S能夠使大鼠回腸平滑肌舒張，抑制平滑肌運動。健康大鼠H2S合成減少可使腸道黏膜產(chǎn)生炎性損傷[24]。本研究兩組患兒糞便發(fā)酵后均可檢測到不同含量的H2S，窒息組在各個培養(yǎng)基中H2S含量均高于對照組，且LAT培養(yǎng)基中含量顯著升高，提示窒息患兒腸道內(nèi)H2S含量偏高。患兒早期腸黏膜功能尚未成熟，過量的H2S堆積可能是早期腸道炎性改變的原因之一。

總之，通過本研究，我們初步了解了窒息患兒腸道內(nèi)菌群產(chǎn)氣的特征，比較了腸道內(nèi)氣體主要成分的差異，為改善窒息患兒早期胃腸功能提供了新的思考方向。但本研究樣本量少，采樣點相對較少，尚需進一步擴大樣本，深入研究窒息新生兒腸道氣體的臨床意義。