原發性中樞神經系統淋巴瘤患者血清miR- 548b、miR- 21的表達及其對預后的預測價值

湯靜，王雄，高慶飛

(湖北文理學院附屬谷城醫院 神經外科，湖北 襄陽 441700)

原發性中樞神經系統淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)是較少見的一種腦腫瘤，具有病程短、侵襲性強、惡性程度高的特點，好發于腦室、腦組織、脊髓、腦膜等部位，在原發顱內腫瘤中占比為1%～3%[1]。該病治療難度較大，進展非?？欤〕炭赡軆H數月時間[2]。而PCNSL的治療缺乏統一標準，即便采取手術、放療、化療等方式，總體效果仍不夠理想[3]。如何盡早對PCNSL進行診斷并提出針對性治療方案，仍是臨床研究的難點。研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)與腫瘤細胞侵襲、凋亡、轉移、增殖密切相關，在腫瘤疾病中具有調節作用[4]。熊艷等[5]研究指出miR- 548b可通過調控腫瘤轉移相關蛋白- 2，抑制惡性膠質瘤細胞增殖，提示miR- 548b可能具有抗癌作用。李麗等[6]發現，黏膜相關淋巴樣組織結外邊緣區淋巴瘤組織中miR- 21呈過表達，對細胞增殖與凋亡有調節作用。上述研究提示miR- 548b、miR- 21表達可能與腫瘤發生有關，但現階段臨床尚未完全明確二者與PCNSL病理特征及預后的關系，故本研究對此進行探討，以期為PCNSL的靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2013年5月至2019年5月收治的PCNSL患者84例為PCNSL組，同期于我院進行體檢的65例健康志愿者為對照組。本研究方案獲醫院倫理委員會批準，兩組研究對象基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。納入標準：(1) PCNSL組：經病理診斷證實為PCNSL(均為B細胞淋巴瘤)，未見中樞神經系統以外的部位累及；MRI、CT等影像學檢查提示無外周病變；年齡≥18歲；近3個月內無免疫抑制劑應用史；自愿簽署同意書。(2) 對照組：同期體檢的健康志愿者，無中樞神經系統病變；年齡≥18歲；近3個月內無免疫抑制劑應用史；自愿簽署同意書。排除標準：患其他類型的原發性腫瘤；既往有器官移植術史；伴有其他部位淋巴瘤；既往有心、腦血管病史；肝、腎等重要臟器功能不全；患血液系統疾病。

表1 兩組研究對象基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 miR- 548b、miR- 21檢測 PCNSL組于入院第1天采血，對照組在體檢當日采血。采集空腹肘靜脈血3 ml，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，保存至-80 ℃備用。經實時逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real- time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT- PCR)檢測血清miR- 548b、miR- 21表達水平。主要儀器為7900HT型熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)、Mx3005P型PCR擴增儀(美國Stratagene公司)、AVANTIJ- 15型高速離心機(美國Beckman公司)。主要試劑為逆轉錄試劑、Trizol試劑、PCR試劑、異丙醇、氯仿、瓊脂糖，購自美國Invitrogen生命技術公司。根據Trizol試劑說明書對總RNA進行提取，檢測其純度與濃度，并按照逆轉錄試劑行逆轉錄，合成cDNA，通過熒光PCR儀測定目的基因表達量。引物序列：miR- 548b上、下游序列分別為5′- GCTAGTCCTGACTCAGCCAGT- 3′、5′- GTGCCAGCTGCAGTGGGGGAG- 3′，miR- 21上、下游序列分別為5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′、5′- GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT- 3′，內參引物U6上、下游序列分別為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′、5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。反應條件：95 ℃ 10 min預變性；95 ℃ 15 s變性，60 ℃退火、延伸60 s，40個循環。以2-ΔΔCt表示miR- 548b、miR- 21表達水平。

1.2.2 隨訪分析 隨訪36個月，記錄患者3年累積生存率，隨訪期間根據醫囑進行復查。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件行數據分析，分別以常數(百分比)、均數±標準差表示計數、計量資料，分別行χ2、獨立樣本t檢驗。通過log- rankχ2檢驗分析不同血清miR- 548b、miR- 21表達患者的生存情況，繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析二者評估預后的曲線下面積(area under curve，AUC)。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組血清miR- 548b、miR- 21表達水平比較

PCNSL組血清miR- 548b表達水平為0.87±0.21，低于對照組的1.56±0.48，PCNSL組血清miR- 21表達水平為3.99±0.76，高于對照組的1.21±0.45，兩組間差異有統計學意義(分別t=11.804、t=26.145，均P<0.001)。

2.2 血清miR- 548b、miR- 21表達與PCNSL病理特征的關系

以PCNSL組血清miR- 548b表達均值為界，分成高表達組與低表達組，血清miR- 548b表達≥均值為高表達組，否則為低表達組。miR- 548b低表達組、miR- 21高表達組腫瘤數目≥2個、腫瘤大小≥3 cm、深部病變占比均高于miR- 548b高表達組、miR- 21低表達組(P<0.05)，見表2。

表2 血清miR- 548b、miR- 21表達與PCNSL病理特征的關系 例

2.3 不同miR- 548b、miR- 21表達患者的預后分析

miR- 548b高表達組3年累積生存率為56.52%，高于低表達組的28.95%(log- rankχ2=6.420，P=0.011)，見圖1。miR- 21高表達組3年累積生存率為31.82%，低于低表達組的57.50%(log- rankχ2=5.607，P=0.018)，見圖2。

圖1 不同miR- 548b表達患者的累積生存率

圖2 不同miR- 21表達患者的累積生存率

2.4 血清miR- 548b、miR- 21表達對PCNSL預后的評估價值分析

根據患者生存、死亡情況分成生存組(37例)與死亡組(47例)。生存組血清miR- 548b、miR- 21表達分別為0.98±0.10、3.55±0.32，死亡組分別為0.78±0.12、4.33±0.42。生存組血清miR- 548b表達高于死亡組，miR- 21表達低于死亡組(t=8.150、9.355，均P<0.001)。血清miR- 548b、miR- 21表達對預后的評估價值見表3。

表3 血清miR- 548b、miR- 21表達對PCNSL預后的評估價值

3 討 論

PCNSL是一種較少見的惡性腫瘤，主要累及中樞神經系統，臨床表現多樣，包括視力或視野改變、肢體無力、顱內壓增高等，惡變程度高，預后非常差[7]。該病現階段的治療方式包括化療、放療、手術、造血干細胞移植等，雖有一定效果，但患者遠期總體生存率仍未見明顯提升[8]。近年來研究提出，miRNA與彌漫大B細胞淋巴瘤的發生及進展有關，這種內源性非編碼RNA對基因表達有調控作用，可調節與參與腫瘤細胞的凋亡、增殖以及分化過程，其異常表達甚至會影響疾病預后[9]。通過尋求與PCNSL相關的miRNA，可能對PCNSL病情評估及預后預測有重要意義。

有學者發現，miR- 548b- 3p可能通過抑制磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol- 3- kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路，對癌細胞增殖進行抑制[10]。曹慧琴等[11]研究則提示淋巴瘤患者的血漿miR- 21表達上調，并認為其表達與淋巴瘤進展存在關聯。這表明miR- 548b、miR- 21可能在淋巴瘤進展中發揮了調控作用，本研究通過分析發現PCNSL患者的血清miR- 548b表達下調以及miR- 21表達上調，提示二者表達異常與PCNSL有關。miR- 548b是miR- 548家族的一員，它可能通過激活AKT信號、調節細胞周期蛋白與基質金屬蛋白酶發揮作用[12]。miR- 548b可能通過調節T- reg細胞、輔助性T細胞1/輔助性T細胞2，從而抑制腫瘤細胞的生長[13]。miR- 21在腫瘤進展中有重要的調節作用，它可以通過多種途徑加速細胞增殖，例如其能作用于轉化生長因子- β、P53蛋白等，參與癌癥進展[14]。本研究顯示，PCNSL患者血清miR- 548b、miR- 21表達與腫瘤數目、腫瘤直徑以及深部病變有關。在本次納入的miR- 548b、miR- 21兩項指標中，miR- 548b在PCNSL中具有抗癌作用，而miR- 21則主要為促癌作用，miR- 548b表達下降以及miR- 21表達增高可能導致PCNSL進一步進展，促使腫瘤體積增大、數目增多，并侵襲深部組織，引起深部病變，導致腫瘤侵襲性增強。

如何改善PCNSL的預后一直是臨床研究的重點與難點問題，尋求與PCNSL預后相關的miRNA，對改善預后有重要意義。在本研究中，低表達miR- 548b與高表達miR- 21會降低患者3年累積生存率，二者對預后評估有一定價值。miR- 548b可通過對轉移腫瘤相關蛋白- 2進行抑制，在惡性膠質瘤中發揮抑癌功能，過表達的miR- 548b能阻斷腫瘤增長途徑[15]。miR- 21表達增高可通過調節磷酸酶和張力蛋白同源物表達參與淋巴瘤發生過程[16]。miR- 21可能通過發揮促癌基因作用，促進腫瘤進展，影響PCNSL預后。

本研究闡述了miR- 548b、miR- 21與PCNSL患者病理特征及預后的關系，證實二者異常表達對PCNSL病情影響較大，且容易導致預后不良，臨床有望通過對二者進行檢測預測PCNSL的預后。

綜上所述，PCNSL患者血清miR- 548b表達下調且miR- 21表達上調，二者表達對PCNSL預后評估有一定價值。本研究也存在不足，例如因PCNSL屬于較少見的腫瘤，再加上受研究時間限制，因而納入樣本較少，日后還需要擴大樣本量進一步分析二者在PCNSL發生、進展中的作用機制。