基質金屬蛋白酶3在舌鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義

袁碩，高炳菊，李斌，仝越越

(1.東南大學附屬中大醫(yī)院 口腔科，江蘇 南京 210048； 2.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，福建 福州 350004)

每年全世界范圍內約有40萬人被確診為口腔癌，20萬人死于口腔癌[1]。舌鱗狀細胞癌是最常見且致死率最高的口腔癌，目前公認的治療方案是以手術切除為主的綜合序列治療，但是術后生存率仍然不理想(為40%～50%)[2]，因此需要從分子水平更進一步研究舌癌的病理機制，從而對舌癌的治療提供有效的幫助。基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)屬于基質降解酶類，已被證實與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移有關，但是其在口腔癌尤其是舌癌中的研究較少。本研究旨在探討MMP3在舌癌中的作用，以期在分子水平探索舌癌治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象及標本來源 選擇福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科手術切除、術后病理證實為舌鱗狀細胞癌的標本49例(均未行放療和化療)，切取新鮮的原發(fā)灶及癌旁正常組織，立即保存于液氮中，用于提取RNA。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄及擴增試劑盒(日本TaKaRa公司)，DEPC水(中國天根生化科技有限公司)，所有引物均由上海鉑尚生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA提取 取新鮮組織約200 mg于勻漿管中，加入1 ml Trizol，以5 m·s-1的速率勻漿30 s，間隔5 min并重復以上步驟5次，靜置5 min后加入200 μl氯仿，劇烈振蕩15 s并靜置3 min，12 000 r·min-1離心15 min后吸上層水樣液體500 μl于新EP管并加等體積異丙醇，輕搖混勻冰上靜置15 min，12 000 r·min-1離心10 min后留沉淀并用預冷的75%乙醇洗滌，7 500 r·min-1離心5 min，棄上清并干燥5 min，加入DEPC水20 μl混勻。取2 μl所得RNA于紫外分光光度計下檢測OD260 nm、OD280 nm及其比值(均大于1.9)確定RNA濃度及純度。

1.2.2 逆轉錄cDNA 按照逆轉錄試劑盒操作體系進行cDNA的逆轉錄并用于擴增模板。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應 根據擴增試劑盒操作說明配置反應體系，引物序列見表1。PCR反應參數如下：預變性95 ℃ 1 min；然后95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 共40次循環(huán)。每個EP管的熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環(huán)數定義為CT值，采用2-ΔΔCt法計算實驗組與對照組的倍數關系并取對數后繪制成柱狀圖，各組目的基因的表達均以內參基因ACTB校正。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理

每組實驗重復3次，所有數據采用SPSS 20.0軟件分析，兩兩比較采用配對t檢驗，臨床資料分析采用Fisher確切概率法；應用Prism 5.0軟件(GraphPad)作圖。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4 生物信息學分析

1.4.1 數據資料收集及處理 從TCGA(https:∥cancergenome.nih.gov/)數據庫中下載舌癌的基因表達譜數據和相關的臨床信息，剔除隨訪信息和臨床參數不完整的病例，共納入138例舌癌患者，包含13例正常組織和125例舌癌組織，整理樣本數據并采用R軟件預處理，提取MMP3單基因樣本及相對應的臨床信息，利用R語言t檢驗分析MMP3在舌癌及癌旁組織中的差異表達情況。

1.4.2 生存分析 根據樣本中MMP3基因表達的中位值將MMP3分為高表達組和低表達組，采用R軟件的“survival”軟件包進行生存分析并繪制生存曲線。將各個樣本MMP3表達量與生存信息相結合，應用Kaplan- Meier生存曲線聯(lián)合Log- rank檢驗對數據集進行生存分析，判斷MMP3對患者預后的預測價值。

1.4.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA) 采用 GSEA 4.0(http:∥software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)進行GSEA，尋找MMP3影響腫瘤發(fā)生發(fā)展可能的生物信號通路。采用GSEA網站的MsigDB數據庫獲取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數據集，設置分析置換次數為1 000次，顯著富集基因集須滿足以下條件：錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.25，P<0.05。

2 結 果

2.1 MMP3在舌癌組織中高表達

在選取的49對配對組織中，MMP3 mRNA在癌組織相對高表達的有42對(85.7%)，而另外7對在癌旁組織中相對高表達，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-8.092，P<0.05)。繪成柱狀圖如圖1，統(tǒng)計結果如圖2。

圖1 MMP3在舌癌及癌旁組織中相對表達情況

a與癌旁組織比較，P<0.05

2.2 舌癌患者癌組織中MMP3高表達的意義

MMP3高表達與舌癌的淋巴轉移有關，而與患者性別、年齡、原發(fā)腫瘤大小及腫瘤細胞的分化無明顯相關，見表2。MMP3表達與淋巴轉移關系的統(tǒng)計結果P<0.05，提示MMP3高表達可促進舌癌的淋巴轉移。

表2 患者癌組織中MMP3表達與臨床病理特征的關系

2.3 TCGA數據庫中MMP3在舌癌及癌旁組織中的表達情況

對TCGA數據庫中MMP3在舌癌組織(125例)及癌旁組織(13例)中的相對表達分析顯示，在癌組織中MMP3的表達量上調(t=-18.671，P<0.05)，提示MMP3在舌癌中可能是促癌基因，見圖3。

a 與癌旁組織比較，P<0.05

2.4 MMP3表達對舌癌預后的影響

根據TCGA數據庫樣本中MMP3基因的表達中位值將MMP3表達分為高表達組與低表達組，進行生存分析并繪制生存曲線，結果顯示，MMP3高表達患者生存周期更短而MMP3低表達患者生存周期更長，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.03)，說明高表達MMP3與舌癌的不良預后有關，如圖4。

a 與MMP3高表達組比較，P<0.05

2.5 MMP3相關信號通路富集分析

GSEA結果顯示，MMP3高表達樣本顯著富集至細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、造血細胞調控信號通路、細胞外基質受體相互作用信號通路、趨化因子信號通路及JAK絡氨酸激酶信號通路等基因集，提示MMP3可能通過多種生物信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3 討 論

舌癌是最常見的口腔癌，大多是鱗狀細胞癌，較常淋巴轉移至頸部，這給舌癌的治療帶來了困難。目前舌癌的治療以外科手術切除為主、放化療為輔，但是預后仍然不是很理想。因此，尋找與舌癌發(fā)生發(fā)展相關的分子，并研究其作用機制，以求對舌癌治療帶來新的突破顯得十分必要。

MMP是一大類需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子的分泌型蛋白[3]。目前已研究發(fā)現(xiàn)其參與多種腫瘤的病理過程，包括凋亡、免疫、轉移及血管再生[4]。

在之前的研究中，本文作者等[5]通過體外分子生物學實驗及裸鼠體內高轉移模型發(fā)現(xiàn)MMP7可促進舌癌的增殖、遷移和侵襲。MMP3是家族中的基質降解酶類，與MMP7具有同源性，被認為是多種腫瘤，包括胃癌[6]、食管癌[7]、肺癌[8]、膀胱癌[9]、宮頸癌[10]等的癌基因。

與全身其他腫瘤的研究結果類似，Tanis等[11]利用二代測序技術證實MMP3在口腔鱗癌組織中顯著高表達，可能是口腔癌的癌基因。而Agha- Hosseini等[12]通過ELISA實驗對30例口腔扁平苔蘚(癌前病變)和20例口腔鱗狀細胞癌患者血液及唾液中分泌型MMP3的檢測發(fā)現(xiàn)，鱗癌患者的MMP3表達量顯著增高且更高分級的鱗癌MMP3表達更高，這說明MMP3在口腔鱗癌癌變過程中發(fā)揮重要作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)，MMP3作為mic- 519d的下游基因促進口腔鱗狀細胞癌的轉移，并且高表達MMP3預示著更差的細胞分化、更高的腫瘤分級及更短的術后生存周期[13]，但MMP3在舌癌中的作用較少有人關注。本研究比較癌與癌旁標本中MMP3的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，癌組織中MMP3的表達水平明顯高于相應的癌旁組織，這與Agha- Hosseini等[12]的研究結果類似，不同的是其選取了癌前病變組織以及測量了MMP3蛋白水平的變化，但結果均說明了MMP3的促癌作用。同時本研究分析MMP3表達的臨床意義發(fā)現(xiàn)，MMP3表達與舌癌的淋巴轉移有關，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤細胞的分化無明顯相關，但Jin等[13]發(fā)現(xiàn)MMP3與口腔癌的細胞分化及淋巴轉移均相關，這可能跟研究樣本量多少以及標本選擇有關，更多的結果有待以后更深入的研究。另外，為了進一步驗證本研究結果，我們利用生物信息學方法在TCGA公共數據庫中挖掘信息，同樣發(fā)現(xiàn)MMP3在舌癌組織中高表達且高表達MMP3的患者預后更差，這都說明了MMP3在舌癌中扮演著促癌基因的作用。而關于MMP3如何發(fā)揮促癌作用，本研究發(fā)現(xiàn)高表達MMP3功能顯著富集至細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、造血細胞調控信號通路、細胞外基質受體相互作用信號通路、趨化因子信號通路及JAK絡氨酸激酶信號通路等基因集，提示MMP3可能通過多種生物信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究不足之處是缺少體外細胞分子功能實驗和體內動物實驗以及MMP3如何調控的分子機制等的相關研究，這也提供了后續(xù)研究的思路。