超聲造影評價兔失血性休克復蘇早期腎血流灌注及與腎功能的相關性

何晶玲，林嫻，龍春艷，魏芳，李葉闊

1. 廣東省中醫院 超聲影像科，廣東 廣州 510120；2. 中國人民解放軍南部戰區總醫院 心胸外科，廣東 廣州 510010

引言

失血性休克（Hemorrhagic Shock，HS）是一種臨床常見的急危重癥，屬于低血容量性休克，多見于急性的、速度較快的失血，若不及時處理，可導致多器官功能障礙綜合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS），甚至死亡[1]。有研究發現傷后救治時間超過8 h死亡率將增長到85%[2]。低血容量休克的復蘇指南中指出治療的關鍵主要是解除血液大量丟失的原因，增加有效循環血容量，改善組織器官的血流灌注[3]。而休克時因全身血流灌注減少、全身血液重新分布的特點，腎臟是最早且易受損的器官之一，HS可導致急性腎功能損害，其發生率約35%。研究認為腎血流動力學變化與腎損害程度密切相關[4-5]，因此監測腎臟的血流灌注量具有重要的意義。本研究擬應用超聲造影（Contrast-enhanced Ultrasound，CEUS）技術觀察HS復蘇早期腎血流灌注量的變化，以期為臨床HS患者的診治提供一種新的監測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只健康新西蘭大耳白兔[(使用許可證號：SYXK(粵)2014-0100）]，雌雄不限，體重（2.753±0.266）kg，于恒溫動物房（22～26 ℃）適應性喂養3 d。本實驗經中國人民解放軍南部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 動物模型及分組

耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉實驗兔，置入22 G的留置針，注射肝素鈉（200 U/kg）使其全身肝素化；分離右側頸動脈并插管，經三通管接有創血壓傳感器，另一側連接至心電監護儀，待血壓曲線平穩，記錄心電監護儀上的生理指標，包括平均動脈壓（Mean Arterial Pressure，MAP）、心率（Heart Rate，HR）、呼吸頻率（Respiratory Rate，RR）及血氧飽和度（SaO2）。左側股靜脈置管后作為液體復蘇的輸液通道，復蘇液體為比例2:1的晶體、膠體（乳酸鈉林格注射液，羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液）[6]。按照Wiggers改良法[7]建立HS的動物模型，經頸動脈放血，放血速度為2.0 mL/(kg·min)，待MAP穩定在35～40 mmHg維持1 h后進行液體復蘇，輸液的速度與放血速度基本保持一致，待MAP維持于80 mmHg為復蘇成功。

將32只實驗兔隨機分成4組，1組作為正常對照組，其余3組建立HS動物模型，其中1組作為休克組，其余2組按照復蘇治療時間的不同，隨機分為復蘇2 h組、復蘇6 h組。

1.3 儀器及CEUS檢查

采用GE Logiq-E9（America）彩色多普勒超聲診斷儀，配置9L-D探頭（6～9 MHz），配備時間-強度曲線（Time-Intensity Curve，TIC）軟件包，造影過程中保持儀器設置一致（頻率Gen、機械指數0.14、聚焦深度4 cm等）。CEUS的造影劑采用SonoVue（Bracco公司），使用前加5 mL生理鹽水，振蕩成微泡混懸液備用。經耳緣靜脈團注0.1 mL/kg的混懸液，后尾推1 mL的生理鹽水沖管。灰階圖像中選取腎臟的最大截面，團注造影劑同時啟動圖像采集并觀察造影圖像的變化，記錄100 s后以DICOM格式存儲數據。應用TIC軟件分析，選取直徑為3 mm的腎皮質區作為感興趣區（Region of Interest，ROI），方向與聲束垂直，分析時選擇伽馬擬合，得出參數，分析TIC曲線的峰值強度幅度（Amplitude of Peak Intensity，A）、達峰時間（Time to Peak，TTP）、曲線下面積（Area Under the Curve，AUC）、曲線上升支斜率（Gradient Between Start Frame to Peak Frame，Grad）。

1.4 腎功能檢查及病理學檢查

造影結束后經左側股靜脈取靜脈血2～3 mL，檢測腎功能包括肌酐（Creatinine，Cr）及尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）；隨后處死實驗兔，迅速取腎組織觀察大體形態，取部分組織制作成標本經蘇木精-伊紅（Hematine-Eosine，HE）染色觀察病理改變。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件分析所得數據，計量資料均以±s表示，組間差異采用單因素方差分析來進行，兩兩比較采用LSD法，運用Pearson相關分析對TIC曲線參數與腎功能之間的相關性進行分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗前4組實驗兔基本指標比較

MAP、RR、HR、SaO2統計分析結果均顯示差異無統計學意義（P＞0.05，表1），提示4組之間均衡性良好。

表1 各組實驗兔初始基本指標比較（±s）

表1 各組實驗兔初始基本指標比較（±s）

組別 MAP/mmHg HR/min-1RR/min-1 SaO2/%正常對照組106.750±4.062 244.500±4.598 44.375±2.559 97.875±1.807休克組103.500±3.338 245.000±4.105 46.625±3.292 97.125±2.295復蘇2 h組106.500±3.703 246.000±4.174 46.250±2.121 97.875±1.642 98.000±1.851 F值 1.620 0.167 1.100 0.350 P值 0.207 0.917 0.366 0.790復蘇6 h組103.875±4.015 245.125±4.356 45.875±2.531

2.2 灰階超聲、CEUS造影結果

灰階超聲顯示各組實驗兔的腎臟大小未見異常，皮、髓質界線清晰，實質回聲均勻，腎實質及腎竇比例正常。各組實驗兔均順利完成腎臟CEUS過程，團注造影劑后，造影劑經腎各級動脈、腎皮質及腎髓質呈“火球樣”放射狀動態增強，由髓質向中央緩慢增強，強度達峰后皮質顯影逐漸消退，直至造影劑完全廓清，這一過程反映了造影劑在腎臟的渡越過程（圖1）。

圖1 ROI（黃圈）處獲取的TIC曲線

2.3 CEUS定量分析

TIC曲線各定量參數結果顯示：與正常對照組比較，休克組TTP明顯延長，A、AUC、Grad降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；復蘇2 h組與休克組對比，A、AUC增加，Grad升高，TTP減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；但與正常對照組比較，TTP、Grad仍有統計學意義（P＜0.05）；復蘇6 h組各參數與休克組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），與正常對照組比較參數差異性不顯著（表2）。

表2 各組實驗兔腎皮質CEUS定量灌注參數比較（±s）

表2 各組實驗兔腎皮質CEUS定量灌注參數比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與休克組比較，bP＜0.05。

組別 A/dB TTP/s AUC/dBs Grad/（dB/s）正常對照組15.916±1.514 3.422±0.495 1027.361±45.967 4.385±0.425休克組11.174±1.052a 5.527±0.653a 809.095±19.820a 2.918±0.397a復蘇2 h組14.698±1.480b 4.780±0.572ab 1019.058±79.534b 3.026±0.296ab 4.186±0.574b F值 20.974 20.966 29.143 24.661 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001復蘇6 h組14.973±0.99b 3.921±0.568b 1004.903±56.041b

2.4 實驗室指標分析

與正常對照組比較，休克組BUN及Cr升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；液體復蘇后，復蘇2 h組BUN、Cr較前降低，與休克組和正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；復蘇6 h組參數值與休克組比較差異有統計學意義（P＜0.05），與正常對照組比較參數差異性不顯著（表3）。

表3 不同狀態下，各組實驗兔腎功能指標比較（±s）

表3 不同狀態下，各組實驗兔腎功能指標比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與休克組比較，bP＜0.05。

組別 BUN/（mmol/L） Cr/（μmol/L）正常對照組 5.763±0.534 67.710±3.109休克組 8.000±0.453a 114.110±6.396a復蘇2 h組 6.538±0.627ab 82.500±5.264ab復蘇6 h組 5.713±0.188b 72.880±5.718b F值 39.561 124.716 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 超聲造影參數與實驗室指標BUN、Cr的相關性分析

結果顯示A、AUC、Grad與BUN呈負相關（r=-0.712、-0.768、-0.597，P＜0.05），TTP與BUN呈正相關（r=0.764，P＜0.05），A、AUC、Grad與Cr呈負相關（r=-0.767、-0.826、-0.680，P＜0.05），TTP與Cr呈正相關（r=0.773，P＜0.05）；其中AUC與實驗室指標BUN、Cr的相關性最好。

2.6 病理結果

正常對照組所見腎臟的腎小管、腎小球無明顯病理改變（圖2a）；休克組腎小管上皮細胞可見腫脹，腎小球結構無明顯改變，血管內見少量充血，腎間質可見炎癥細胞浸潤（圖2b）；復蘇2 h組腎小管上皮細胞腫脹，可見少量炎癥細胞，腎血管輕度充血但較休克組減輕；復蘇6 h組腎小管上皮細胞腫脹明顯減輕（圖2c～d）。

圖2 各組兔腎臟病理圖（HE染色，200×）

3 討論

HS是低血容量性休克中的一種，是臨床上最常見、最主要的休克類型，HS的病理生理機制主要是大量血液快速丟失使有效循環血容量減少，組織器官血容量的灌注不足，導致缺血、缺氧，組織器官的功能受到損害可導致MODS，甚至引起死亡[1,8-9]。腎臟的血供豐富，腎皮質的血流量約占腎臟總血流量的90%[10]，且腎臟本身的毛細血管網使得腎臟有分泌及排泄的功能，所以腎臟可作為血流灌注測定的理想器官，有研究認為一些腎臟相關疾病的診斷與治療與腎血流灌注的變化有著密切關系[11]。所以，實時、無創、便捷地評價HS腎血流灌注的變化有著重要的意義。本研究通過建立HS模型，模擬液體復蘇早期應用CEUS技術觀察實驗兔腎血流灌注的變化規律，評估該技術在治療中的應用價值。

目前臨床和動物研究中腎臟功能檢查最常用的實驗室指標是BUN和Cr。BUN是含氮有機物及蛋白質的終產物，而Cr是肌肉在人體內的代謝產物，由腎小球濾過排出體外，腎臟的功能之一就是濾過和排泄含氮廢物。本研究中休克組BUN、Cr較正常對照組升高，而休克后腎血流灌注下降，腎小球的濾過率下降，炎性介質滲出，血管內皮損傷，多種因素造成腎功能受到一定損傷；液體復蘇組BUN、Cr稍減低，當腎循環血量得到改善時，腎小球濾過率增加，腎功能也逐漸得到恢復，實驗中液體復蘇有效地恢復了腎臟的血容量，降低了腎臟BUN、Cr的含量，減輕了對腎臟的損傷，復蘇6 h組各參數與休克組比較均有統計學差異，這與Rhind等的研究結果基本一致[12]。然而Salmon-Gandonniege等[13]和Hall等[14]的研究顯示BUN、Cr可作為判斷腎功能的指標，但卻并非敏感指標，因為只有當腎小球濾過率下降到一定水平時數值才會上升，而且該指標還受檢測方法和代謝狀態等多個因素影響。

因此，我們還可以應用影像學方法來評估腎臟的血流灌注，臨床上較常見的影像學方法主要包括CEUS、核素顯像、CT及MRI灌注成像，其在臨床中都得到了很好的應用[15-16]；然而核素顯像有一定的放射性危害，而CT及MR灌注成像有對比劑易發生過敏反應、檢查費用較高、機器較大不能床旁應用等不足，限制了這幾種影像學方法在臨床診療中的應用。相比之下，CEUS有著造影劑安全、無放射性危害、儀器可實時操作、靈活性好可用于床邊等優點，可更方便地應用于床旁、實時檢查和重癥患者的實時監護[17-18]。CEUS所使用的造影劑內含的氣體為惰性氣體，穩定性好，造影劑內的微泡直徑為1～5 μm，可隨血液分布至全身，使血管微結構可視化，因此微泡的數目及進出的速率即反映了該組織的微循環灌注狀態[5]。目前，CEUS技術在腎臟相關的慢性疾病、腎臟移植以及腎腫瘤等的診療方面應用廣泛[19-20]。

本研究結果顯示，正常狀態下，TIC曲線可反映CEUS造影劑的微泡在腎皮質微循環灌注的渡越過程。休克組表現為TTP延長，Grad降低，A、AUC減低，與正常對照組比較，有統計學差異，表明休克模型建立成功，與Li等[21]的結果一致；大量失血后有效血容量減少，機體通過啟動腎素-血管緊張素系統、兒茶酚胺等代償機制，刺激壓力感受器使心臟功能加強并完成血液重新分布，優先保證腦和心臟的血供，同時內臟及外周血管平滑肌反應性收縮，腎血流灌注減少，TIC曲線參數AUC反映了這一表現；另外休克時所引起的缺血、缺氧導致炎性介質的滲出，血管通透性增加，形成間質水腫，血管內皮細胞損傷加重白細胞的黏附、聚集，血液濃縮，黏稠度增加[22]，引起了腎血管血流阻力增加[23]，使微泡到達腎皮質微循環的速度減慢，時間也延長，CEUS參數上表現為TTP的延長、Grad的降低，病理圖片上則表現為少量炎性細胞浸潤、腎間質水腫。復蘇2 h組表現為A、AUC的增加，TTP減少、Grad升高，隨著血容量的增加機體的代償機制逐漸恢復，外周血管及內臟血管的擴張減輕了炎性細胞的黏附、聚集，改善了低灌注的狀態[24]，加快了外周血液流動的速度，減低血液的黏稠度。但是與正常對照組比較，TTP、Grad的差異仍有統計學意義，分析認為腎皮質的血流灌注得到了一定的改善；復蘇6 h組各參數與休克組比較均有統計學差異（P＜0.05），且與正常對照組比較差異性不顯著，與實驗室指標BUN、Cr結果一致，這可能是復蘇6 h組實驗兔腎皮質的血流灌注只得到了部分恢復的原因。AUC是指一定時間內ROI區造影劑微泡強度的積分值，與造影劑微泡的數量及速度相關，Grad、A、TTP共同作用引起了AUC的改變，且與實驗室指標Cr、BUN結果存在較顯著的相關性，因此本研究認為AUC可作為血流灌注的一個敏感的指標，同時病理結果也證實了液體復蘇可有效改善組織灌注，減輕由于組織缺血、缺氧引起的細胞水腫及炎性浸潤等表現。

本研究具有一定的局限性，首先實驗動物的樣本量相對較少；其次實驗須在動物麻醉狀態下進行，而在臨床中遇到的病例情況往往更復雜，需要積累更多的研究結果不斷優化后續研究的設計來進行驗證。

4 結論

本研究通過CEUS監測腎皮質區域的血流灌注情況并應用TIC曲線進行量化分析，證實了CEUS技術能夠客觀、敏感且準確地監測腎微循環灌注的改變，可作為一種無創性的監測方法應用于HS的臨床診斷和治療。