骨碎補(bǔ)總黃酮在大鼠骨折愈合過程中組織病理學(xué)研究

王雪峰 薛 徽 楊 松 曹立新 張?jiān)讫?艾中偉

(1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院/骨外科 黑龍江 齊齊哈爾 161000 2 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院/口腔科 黑龍江 齊齊哈爾 161000 3 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院/體檢科 黑龍江 齊齊哈爾 161000 4 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161000)

骨折是指骨完整結(jié)構(gòu)被破壞，是臨床常見創(chuàng)傷性疾病，導(dǎo)致其發(fā)病的因素多樣，骨折治療原則以恢復(fù)骨骼正常結(jié)構(gòu)及功能，臨床對(duì)于不同的骨折有著不同的治療方案，臨床常見內(nèi)固定術(shù)及石膏固定法。而骨不連，骨延遲愈合是困擾臨床多年的疑難問題[1-2]。隨著中醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，用于輔助臨床治療的效果顯著，中醫(yī)認(rèn)為，骨生長(zhǎng)發(fā)育取決于腎精勝衰，腎精不足，則髓不榮、骨生慢，故而生骨以補(bǔ)腎為主[3]。骨碎補(bǔ)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，具有補(bǔ)腎固元，消腫祛瘀之功效[4]。骨碎補(bǔ)黃酮(TFDF)是其主要有效成分，近年多位學(xué)者表示骨碎補(bǔ)黃酮(TFDF)可有效促進(jìn)骨鈣吸收，從而達(dá)到骨愈合的作用[5-6]。但對(duì)于其作用機(jī)制臨床尚不明確，本研究以脛骨骨折為例，建立SD大鼠模型，以組織學(xué)病理研究為基礎(chǔ)進(jìn)行骨碎補(bǔ)黃酮促進(jìn)骨愈合機(jī)制研究觀察。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)大鼠60只，雄性，10周齡，體重210～220 g，購于吉林和元生物工程股份有限公司，許可證號(hào)：SYXK(吉)2021-0005；在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)，并自由采食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品、試劑與儀器

TFDF采自北京岐黃制藥有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥試字Z20020002)；骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)試劑盒均采自上海酶研生物科技有限公司；阿爾辛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品試劑采自深圳海思安生物科技有限公司；顯微CT(Micro-CT)采自GE公司 Locus SP型。

1.3實(shí)驗(yàn)大鼠分組、模型構(gòu)建及給藥

將60只大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為藥物組、對(duì)照組，每組各30只。

大鼠均采用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，待麻醉起效后，將大鼠右下肢皮膚進(jìn)行備皮處理后行骨折及內(nèi)固定處理：將大鼠以仰臥位，采用聚維酮碘進(jìn)行皮膚消毒，在大鼠脛骨前方做一長(zhǎng)約2cm縱行切口，將髕韌帶完全暴露，將注射器針頭從內(nèi)側(cè)髕韌帶遠(yuǎn)端插入點(diǎn)插入大鼠脛骨髓腔，穿破脛骨，用刀片造成脛骨橫向骨折。骨折形成后，以注射器針頭作為內(nèi)固定器穿入大鼠脛骨髓腔內(nèi)，將多余的針頭剪掉并消毒縫合，將同側(cè)腓骨進(jìn)行保留。術(shù)畢在大鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行X線檢查，確保實(shí)驗(yàn)大鼠均為脛骨中斷單橫骨折。最后將實(shí)驗(yàn)大鼠送至保溫箱等待自然復(fù)蘇。并給予為期3d的抗炎治療。于術(shù)后第1d開始每日給予藥物組大鼠灌腸喂養(yǎng)TFDF 0.3ml/只，對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水灌腸，每日對(duì)大鼠飲食、活動(dòng)、毛色、排泄等一般情況進(jìn)行觀察。本研究所有涉及動(dòng)物的操作均得到我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

1.4指標(biāo)觀察

分別于術(shù)后第7d、14d、21d各組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行斷髓處死后取材。取眼球血進(jìn)行血清學(xué)分析，采用酶聯(lián)吸附法檢測(cè)血清骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)水平，操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行；取脛骨標(biāo)本行10%中性甲醛固定48h后取出固定針，置于檢測(cè)試管內(nèi)行Micro-CT檢查，對(duì)骨痂整體進(jìn)行觀察并行定量分析，計(jì)算骨痂體積及密度；取脛骨骨折部位行石蠟組織切片制備，骨折線與切片方向垂直，切片行阿爾辛藍(lán)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨骨痂及成骨組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織病理變化結(jié)果

術(shù)后7d，骨折部位愈合以纖維骨痂生成為主，三組間觀察無明顯差異；術(shù)后14d，軟骨骨痂開始生成取代纖維骨痂，藥物組軟骨骨痂密度明顯高于對(duì)照組；術(shù)后21d，軟骨骨痂周圍開始出現(xiàn)原始骨小梁，骨折端也逐漸有破骨細(xì)胞的生成，藥物組骨小梁密度高于對(duì)照組。

2.2 血清學(xué)分析結(jié)果

兩組在術(shù)后7d，OCN、ALP及VEGF水平比較無差異(P>0.05)，術(shù)后14d及21d，兩組OCN、ALP及VEGF水平均有上升趨勢(shì)(P<0.05)，且藥物組均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 血清學(xué)分析結(jié)果

2.3 骨痂體積及密度分析結(jié)果

兩組在術(shù)后7d，骨痂體積、骨痂密度水平比較無差異(P>0.05)，術(shù)后14d及21d，兩組骨痂體積、骨痂密度水平均有上升趨勢(shì)(P<0.05)，且藥物組均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 骨痂體積及密度分析結(jié)果

3 討論

脛骨是機(jī)體承重的重要骨骼，位于皮下，解剖位較為表淺，因而在經(jīng)受暴力侵害時(shí)，常有骨折發(fā)現(xiàn)，為臨床常見下肢創(chuàng)傷，以脛骨干骨折常見。臨床治療常以外科手術(shù)復(fù)位固定為主，功能康復(fù)為輔，大多數(shù)骨折患者均可恢復(fù)良好，但仍有少部分人出現(xiàn)骨不連，骨愈合滯后等情況，西醫(yī)治療較為困難，且易有感染發(fā)生，對(duì)患者預(yù)后不利。隨著中醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，現(xiàn)已成為臨床常見輔助治療，具有低成本、低風(fēng)險(xiǎn)、療效佳的優(yōu)勢(shì)，得到患者及臨床醫(yī)師的青睞。本研究對(duì)骨碎補(bǔ)對(duì)骨愈合的作用進(jìn)行觀察。骨碎補(bǔ)內(nèi)含豐富的黃酮，其TFDF為其主要性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)[7]稱黃酮具有修護(hù)機(jī)體組織，促進(jìn)新陳代謝，增進(jìn)傷口愈合的作用。既往研究顯示[8-9]，黃酮具有誘導(dǎo)骨活性因子分泌，改善成骨功能的作用。本研究病理組織顯示，藥物組恢復(fù)情況明顯優(yōu)于對(duì)照組，提示TFDF具有促進(jìn)骨骼愈合的作用。

為了解TFDF促進(jìn)骨愈合的作用機(jī)制，本研究對(duì)兩組大鼠骨相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示藥物組大鼠OCN、ALP及VEGF水平上升趨勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照組。OCN是由成骨細(xì)胞及增生的軟骨細(xì)胞合成，具有調(diào)節(jié)骨骼代謝的作用[10]；骨性ALP由成骨細(xì)胞分泌，在骨轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用[11]；VEGF可刺激血管生成，在骨折愈合及骨分化過程中具有主要的血管源性調(diào)節(jié)作用，有效促進(jìn)骨愈合[12]。黃酮可能通過上調(diào)OCN、ALP及VEGF水平促進(jìn)骨愈合。骨痂形成是骨性連接最重要的標(biāo)志，本研究顯示，藥物組骨痂體積及密度增長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組，提示TFDF的使用可加快骨性連接的速度，進(jìn)而促進(jìn)骨愈合。TFDF具有促進(jìn)鈣磷吸收的作用，增加鈣磷沉積，促進(jìn)骨性因子的分泌，提高成骨細(xì)胞的增殖活性，從而加快骨痂組織的生成，促進(jìn)骨愈合[13]。且藥理學(xué)指出黃酮還具有抗炎、改善局部微循環(huán)的作用，可為骨愈合提供良好環(huán)境。本研究顯示術(shù)后7d兩組恢復(fù)情況無明顯差異，可能與TFDF藥效反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。且于病理學(xué)組織分析可見14d后開始有軟骨骨痂生成，藥物組生成情況優(yōu)于對(duì)照組，21d后差距增大，提示臨床使用可延長(zhǎng)其服藥周期，以保證臨床療效。關(guān)于毒副反應(yīng)，本研究30只大鼠在用藥期間均無明顯不良反應(yīng)發(fā)生，提示其安全性較好。

綜上所述，TFDF可能通過上調(diào)OCN、ALP及VEGF水平，促進(jìn)軟骨骨痂生成且加快其向骨性骨痂轉(zhuǎn)變的進(jìn)程，提高骨痂密度促進(jìn)骨愈合；術(shù)后14d出現(xiàn)軟骨生成，21d開始進(jìn)行骨折重建修復(fù)。