鐵電極輔助餐廚垃圾高溫厭氧消化及微生物的耐鹽機理

曲藝源，張景新，何義亮

（上海交通大學中英國際低碳學院，上海 201306）

在厭氧消化過程中，溫度是影響厭氧消化性能的重要因素之一。一般而言，厭氧消化主要分為中溫（35～37℃）厭氧消化和高溫（55～60℃）厭氧消化。在高溫厭氧消化過程中，有機物的水解速率、揮發性固體的去除率和產甲烷量比中溫厭氧消化高。并且在高溫條件下，消化底物中的病原體更少。但是，高溫菌比中溫菌對環境的變化更為敏感。當環境中的NaCl 濃度發生變化時，細胞的活性會受到影響，參與厭氧消化的酶活性下降，同時，高鹽度會使細胞滲透壓增加，導致微生物發生細胞的質壁分離進而導致微生物細胞的死亡。因此，緩解高鹽度對微生物的不良影響對高溫厭氧消化性能的提升具有重要意義。

近年來很多研究表明，添加零價鐵（ZVI）能夠提高厭氧消化的穩定性、微生物的耐鹽能力和細胞活性。大量研究表明，鐵-碳微生物電解池（MEC）在有機污染物降解、工業廢水和有機廢水處理過程中具有強化厭氧消化的作用。并且已有研究表明，ZVI與MEC耦合之后能夠促進微生物的直接種間電子傳遞（DIET），提高系統的產甲烷能力。但是在高溫、高鹽度條件下，ZVI 耦合MEC的厭氧消化系統能否提高微生物的耐鹽能力、提高甲烷產量以及在電化學系統中鐵作為陽極形成的生物膜的微生物結構和強化機制尚不清楚。

本文研究了不同Na濃度的條件下MEC在高溫厭氧消化過程的強化效果，對微生物的群落結構變化和代謝通路進行了分析評估并解釋其耐鹽機理。本研究對強化厭氧消化過程實現能源回收以及含鹽廢棄物處理具有重要指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

接種污泥取自嘉興某生物處理廠的大型厭氧消化罐，餐廚垃圾取自上海市宜浩歐景人才公寓的食堂，主要由大米、面條、肉和蔬菜組成。將餐廚垃圾攪碎并通過混合器均勻混合，接種污泥和餐廚垃圾的特性如表1所示。

表1 接種污泥和餐廚垃圾的元素組成、總固體（TS）和揮發性固體（VS）

1.2 實驗裝置和操作

采用300mL 厭氧玻璃瓶構建單室電發酵反應器。陰極為石墨電極、陽極為鐵電極制成鐵-碳微生物電解池（R1），陰極、陽極均為石墨電極的碳-碳微生物電解池（R2），對照組（C）不使用微生物電解池，并設置三組平行組。加入由厭氧消化池采集的240mL 接種污泥，恒電位設置為0.6V。添加餐廚垃圾的有機負荷為4g VS/L，每次改變鹽度添加一次餐廚垃圾，并用NaCl 分別調節Na濃度分別為0、5g/L、10g/L、15g/L 和20g/L，每6 天添加一次餐廚垃圾并改變鹽度，在Na濃度為20g/L 時實驗重復進行3 次，以驗證耐鹽效果。為了保持嚴格的厭氧消化，用氮氣沖洗100 次，脫去氧氣后，用鋁箔集氣袋密封連接，保持厭氧狀態。pH 調整為6.97，反應器在(55±1)℃的水浴條件下運行，測定Fe、pH、產甲烷量、COD 和揮發性脂肪酸（VFAs）。

1.3 分析方法

（1）VFAs測定 上清液中VFAs測定采用氣相色譜法。樣品預處理：采用3%的磷酸酸化上清液至pH 到4.00 以下，確保上清液中小分子酸處于解離狀態，盛裝于2mL 分析瓶中。采用島津氣相色譜儀（GC-2030），色譜柱溫度60℃，氫火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，FID） 溫度250℃。乙酸、丙酸、丁酸（異丁酸）和戊酸（異戊酸）對應COD 的轉換系數分別為1.07、1.51、1.82、2.04。

（2）宏基因組學分析 取鐵片電極上的生物膜和R1 和C 反應器中實驗后的底泥，向其中加入同體積無水乙醇進行固定，隨后置于-20℃的冰箱中保存。將樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA提取和測序，并進行宏基因組分析。使用引物（TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC）和（TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC） 分別對古菌和細菌進行16S rRNA的擴增。采用高通量測序儀進行高通量測序，得到基因序列通過軟件被分成各種OTU。最后利用GreenGenes 和NCBI 數據庫對得到的OTUs 進行分類，并且進行代謝通路分析。根據數據庫中已有測序微生物基因組的基因功能構成和測序獲得的物種構成推測樣本中的功能基因構成。

（3）其他相關測定指標及方法 pH，玻璃電極法；TS，重量法；VS，灼燒減量法；COD，快速消解分光光度法；氣體成分，氣相色譜法；Fe濃度，鄰菲啰啉分光光度法。

2 結果與討論

2.1 產甲烷量對比分析

不同NaCl 濃度下體系的累積甲烷量如圖1 所示。在未添加NaCl 的情況下，R1的強化效果比較明顯。將Na濃度提高時，R1 產甲烷能力開始下降。添加5g/L Na時，R1反應更快，最高甲烷產量為92mL/g VS，是R2 和C 的1.91 倍和1.84 倍。當Na的含量分別進一步增加到10g/L 和15g/L 時，各反應器的產甲烷能力都不同程度地受到了抑制，這說明NaCl的存在能夠抑制甲烷的產生。但是R1反應器依舊擁有最高的甲烷產量90～120mL/g VS，并且累積產甲烷量最多，在第24 天的時候達到了928.71mL。當Na濃度達到20g/L 的時候，R1 的比甲烷產量以及累積甲烷產量均最高，比甲烷產量為41.71mL/g VS，分別是R2 和C 反應器的1.52 倍和1.58 倍。對照組（C）的比甲烷產量并不是在每個鹽度的第一天達到最大，相對于R1 出現了滯后現象，說明鹽度對高溫產甲烷過程產生了強烈的抑制作用。就累積產甲烷量而言，在R1反應器中，Na投加量從5g/L 增加到20g/L，對應累積產甲烷量最高達到了1110.67mL，相對于R2 和C 反應器的789.31mL 和660.32mL，分 別 提 高 了40.68% 和68.18%。實驗結果表明鐵-碳微生物電解池能夠提高微生物耐鹽能力，促進厭氧消化產甲烷。

圖1 不同反應器中的甲烷產量對比

2.2 不同鹽度下的COD、pH和Fe含量的變化

厭氧消化實驗結束后，對照反應器內的COD濃度為(11500±165)mg/L，如圖2 所示。R2 和R1 反應器內消化污泥的COD 濃度分別為(9120±75)mg/L和(8574±83)mg/L。從圖2 中可以看出，當Na濃度為0 的時候，微生物還處于適應階段，COD 較高，隨著鹽度的增加，COD 的去除效果從10g/L Na之后開始下降。對比不同反應器可以看出，C反應器的COD去除效果最差，Na濃度為10g/L，各反應器的去除效果最好，而Na濃度＞10g/L 的時候，各反應器開始出現不穩定現象，但是R1、R2能夠克服鹽度帶來的不利影響。由此可以看出，鐵-碳微生物電解池在高鹽度條件下具有促進COD 去除和維持高溫系統穩定性的作用。應當指出的是，Na濃度20g/L時，COD 去除效果最差，鹽度的提高對于COD 的去除具有不利影響，這一結果與之前報道的相一致。相應地，pH 隨著Na濃度的增加開始下降，當Na濃度為20g/L 的時候，R1 穩定在7 的水平，但是R2 低于7，而C 的pH 接近6 并且出現酸化的問題，說明鹽度對于高溫厭氧消化具有很強的抑制作用，而鐵-碳微生物電解池在高鹽度條件下對于維持厭氧反應器的系統穩定和緩解反應器酸化具有重要作用。

圖2 不同反應器中COD的含量和pH變化

Fe在厭氧消化過程中的濃度變化情況如圖3所示。可以看出，Fe在溶液中的濃度隨著鹽濃度的上升在Na為10g/L的時候達到最大值4～5mg/L，然后隨著鹽度的不斷提高逐漸達到一個穩定狀態，維持在2～3mg/L。對比固體中鐵含量來看，固體中的鐵含量同樣在Na為10g/L 的時候達到峰值，而產甲烷量同樣在此段時間到達最大值，這可能是因為鐵能夠增強微生物的活性。研究表明鐵對于微生物的厭氧消化過程至關重要，它能夠參與到關鍵酶的合成中，并在氧化還原反應中起到電子載體的作用，從而有助于產生更多甲烷。而固體中的鐵含量隨著鹽濃度的升高而降低，可能是因為鐵被產甲烷菌利用以提高微生物的產甲烷能力。

圖3 Fe含量的變化

2.3 不同鹽度下VFAs的變化

VFAs 是厭氧消化的重要中間產物，是產生甲烷的消化底物。如圖4所示，將NaCl添加到消化反應器中時，VFAs的產生受到很大影響。當Na濃度從0增加到15g/L時，有機酸降解效率呈下降趨勢，Na含量為20g/L 時，有機酸的降解效率最差。鐵-碳微生物電解池對VFAs 的降解效果最好，四種酸的總濃度維持在6000mg COD/L 以下。圖4 顯示了NaCl 對丁酸降解效率的影響。當NaCl 濃度較高的時候，丁酸降解效率降低。隨著鹽度的增加，對照組的丁酸和丙酸的含量升高，證明鹽度升高抑制了揮發性有機酸的乙酸化過程。與對照組相比，R1和R2 反應器能夠促進丁酸轉乙酸。這些數據表明NaCl 的存在抑制了丙酸和丁酸轉化為乙酸，從而抑制了甲烷的產生，而吸附在陽極表面的微生物可以在電的驅動下將有機物氧化為CO。有研究表明，高濃度的Na會導致高滲透壓，這可能導致產甲烷菌的細胞內水分流失并降低微生物中關鍵酶的活性（如脫氫酶）。而通過對比R1和R2可以發現，R2中丙酸的含量是R1的3倍，說明R1能夠很好地將丙酸轉化為乙酸，這說明鐵-碳微生物電解池在促進有機酸的降解、抵抗鹽度方面具有更好的效果。并且鐵的存在能夠調節細胞的滲透壓，維持細胞活性，參與關鍵酶的合成，從而促進產甲烷。這一結果與Feijoo 等報道的利用丙酸的微生物比利用其他有機酸的微生物（如乙酸和丁酸）對高鹽環境的適應能力更小一致。

圖4 不同厭氧消化系統的有機酸含量對比

2.4 微生物群落分析

2.4.1 鹽度對細菌群落結構的影響

厭氧消化系統中屬水平群落豐度如圖5 所示。在高鹽度條件下反應器中出現了一些可降解有機物的耐鹽菌。芽孢桿菌（）是能夠在高鹽條件下生存的細菌，在R1的電極（HFCE）和反應器中的污泥（HFCS）中具有較高的含量，而對照組幾乎沒有，由此可以看出鐵-碳微生物電解能夠富集耐鹽微生物。互營桿菌屬（）是一類產氫產乙酸細菌，在R1的電極（HFCE）的占比大約是對照組中占比的3 倍，有研究報道了能夠促進丙酸轉乙酸過程，從而促進產甲烷，在有機物降解過程中發揮著關鍵作用。鐵-碳微生物電解池對于耐鹽菌的生長有促進作用，并且在高鹽度條件下能夠促進有機物的水解酸化過程。

2.4.2 鹽度對古菌群落結構的影響

從古菌群落結構分析[圖5(b)]可知，鐵電極（HFCE）上最占優勢的菌屬是甲基型產甲烷菌屬（），該菌屬于嗜乙酸型產甲烷菌，是一種耐鹽產甲烷菌，可在產甲烷過程受到限制的時候通過甲基還原產生甲烷。R1反應器中，甲 烷 鬃 毛 菌 屬 （， 又 被 稱 為）是一種產甲烷菌，其在HC、HFCE和HFCS 中的占比分別為5%、10%和20%。相比之下，在HC、HFCE 和HFCS 中的占比分別為47%、22%和43%。這一變化可能與接受電子的方式有關，被證明通過DIET將二氧化碳還原為CH。從電極表面接受電子，使用CO還原產甲烷，通過用乙酸脫羧途徑產生甲烷。這些結果表明，R1中DIET的刺激增強了二氧化碳產甲烷的轉化過程，促進了乙酸型甲烷的生成，而對照組的甲烷生成途徑主要是耗氫產甲烷過程。甲烷桿菌屬（）是一種以甲酸和H/CO生成甲烷為主要原料的微生物，這可能與鐵-碳微生物電解池緩解鹽度抑制有關。結果表明，鐵-碳微生物電解池可以有效地增強耐鹽古菌的富集。在高鹽度條件下，這兩個微生物群落之間的有利相互作用促進了有機物的降解。

圖5 厭氧體系中微生物群落分析

2.4.3 微生物的代謝通路預測

分析微生物群落的代謝通路，可以闡明鐵-碳微生物電解池對微生物代謝的影響。將樣品所測得的編碼基因根據KEGG數據庫進行分類比對，樣品中二級和三級分類的主要相關編碼基因豐度如表2所示。與對照組相比，HFCE 中的細胞生長與死亡、運輸和分解代謝以及碳水化合物的代謝相關編碼基因分別增加了15.4%、43.4%和31.5%，HFCS細胞生長與死亡、運輸和分解代謝以及碳水化合物代謝相關編碼基因分別增加了17.9%、23.1%和31.5%。這進一步證實了鐵-碳微生物電解池有助于增強細胞和酶的代謝、提高微生物的耐鹽能力并且促進餐廚垃圾的水解酸化。通過添加鐵-碳電極的形式，負責能量代謝的氧化磷酸化相關編碼基因Ko00190 已 從376250 增 加 到HFCE 和HFCS 的491036和458464。Ko00260的基因負責甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，從183250 增加到346599 和220412，這些基因是參與酶和細胞的合成和代謝過程的必需基因。與產甲烷過程有關的相對豐度的差異最顯著的是Ko02024，主要負責甲烷的代謝。HFCE 和HFCS 中的Ko02024 基因數分別為768776和537022，而對照組中僅為486743。Ko02024的增強表明鐵-碳微生物電解池有助于促進甲烷化過程。輔酶及維生素的代謝相關編碼基因基因豐度從對照組的1111371 增加到HFCE 和HFCS 中的1435909 和1312539，支持了這種相關性。氨基酸代謝相關編碼基因豐度從200962 增加到HFCE 和HFCS的240707和242947。從這些基因的變化可以看出，鐵在促進微生物的細胞增殖和代謝中起著重要作用，鐵能夠參與關鍵酶的合成，能夠強化甲烷化過程并且提高微生物的耐鹽能力。

表2 KEGG中二級和三級功能分類

2.4.4 甲烷代謝的宏基因組分析

表3 列出了與關鍵產甲烷途徑有關的酶基因。乙酸脫羧和二氧化碳還原是甲烷代謝的基本途徑。鐵-碳微生物電解池中參與乙酸脫羧過程的乙酸激酶（ackA）和乙酰輔酶A 合成酶（acs）的基因豐度高于對照組，Fe 的存在能夠提高乙酸激酶（ackA）的活性，乙酰輔酶A 合成酶通常和脫氫酶以[ACS/CODH]的形式存在，其中含有[4Fe-4S]簇和Ni-Ni-[4Fe-4S]位點，說明鐵-碳微生電解池強化了乙酸產甲烷的過程。此外，氫營養型產甲烷菌參與了完整的CO還原途徑的所有通路。涉及這些通路的重要酶包括：次甲基甲酰四氫甲烷蝶呤環化水解酶（mch）、亞甲基四氫甲烷蝶呤脫氫酶（mtd） 以及5,10-亞甲基四氫甲烷蝶呤還原酶（mer）等。鐵-碳微生物電解池中相關編碼的基因豐度均高于對照組，說明該系統的CO還原為CH的產甲烷途徑很活躍。同時鐵-碳微生物電解池對于利用甲醇、甲酸等甲基類化合物的產甲烷過程中酶的合成也起到了一定的強化作用。因此，通過鐵-碳微生物電解池可以提高酶基因的表達和酶活性，從而促進乙酸脫羧和二氧化碳還原，最終有利于甲烷的產生。

表3 基于KEEG參與甲烷代謝的典型基因豐度

3 結論

（1）隨著體系鹽度的不斷提高，鐵-碳微生物電解池中的產甲烷效果最好，而對照組的產甲烷能力明顯受到抑制。

（2）在適當的電壓下，鐵-碳微生物電解池能夠維持pH 穩定，增強丙酸轉乙酸過程，促進有機物的水解酸化過程。

（3）鐵-碳微生物電解池富集了大量耐鹽微生物，微生物細胞通常具有更高的酶活性和耐鹽能力。

（4）鐵-碳微生物電解池通過在鐵電極表面富集、和-能夠促進甲酸和H/CO產甲烷、甲基途徑產甲烷及DIET，提高餐廚垃圾厭氧消化的產甲烷性能。

COD—— 化學需氧量，mg/L

TS—— 總固體質量分數，%

VS—— 揮發性固體質量分數，%

VFAs—— 揮發性脂肪酸，mgCOD/L