PDMDAAC改性玉米醇溶蛋白負載阿維菌素納米顆粒的制備與性能

李梓泳，陳龍，馬文丹，周紅軍，周新華，2

（1 植物健康創新研究院，仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東省普通高校農用綠色精細化學品重點實驗室，廣東 廣州 510225；2 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000）

農藥是一類重要的農業生產資料，可用于防治病蟲害、調節作物生長、提高農產品收成。傳統的農藥制劑存在粉塵漂移、有機溶劑和表面活性劑使用量大、利用率低等問題。據統計，在農藥噴施的過程中，農藥的分解率高于50%，最終在作物中起效的不到10%。使用載體將易分解的農藥包封起來可降低農藥的分解率并優化其性能，達到提高利用率的目的。納米農藥是一種新興的農藥傳遞系統，具有小粒徑、高比表面積的特點，易被靶標生物吸收。納米農藥可減輕紫外光、氧氣、微生物等分解作用，從而提高制劑穩定性，延長藥效。Hao 等報道了一種功能化的二維氮化硼納米片作為高水分散性的農藥納米載體，具有明顯的pH 響應和抗紫外線照射等性能。Chen等利用改性修飾后的納米介孔硅制備了使用壽命長的環保型緩釋生物農藥，以減少農藥對環境造成的破壞。Zhao等設計了殼聚糖為基材的納米農藥顆粒，能在黃瓜葉片上較好地鋪展并具有較高的黏附性。

因為蛋白質（大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、羽毛蛋白等）、多糖（木質素、纖維素、殼聚糖）等天然聚合物來源豐富、無毒和可生物降解，被廣泛應用于納米農藥。玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要蛋白質，具有獨特的溶解特性使其可通過簡單的方法得到納米粒子，是一種有前景的新型納米載體材料。玉米醇溶蛋白具有疏水性、生物相容性、生物可降解性和能自組裝成納米顆粒的特性，用于各種疏水化合物、藥物、維生素和膳食補充劑的包埋和傳遞。玉米醇溶蛋白納米顆粒易在溶液狀態下聚集，對其進行陽離子改性可提高分散性，且有利于與植物葉面形成靜電作用，提高其潤濕性能。Hao 等使用羧甲基纖維素鈉（CMC）接枝甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羥乙酯的共聚物，最后通過開環作用與乙二醇二縮水甘油醚改性過的Zein 反應，制得的農藥納米顆粒有較高載藥率，但該方法改性步驟相對復雜。二甲基二烯丙基氯化銨（DMDAAC）是一種具有較高實用價值的陽離子單體，具有分子量易于控制、殺菌性能好、價格低廉、無毒、正電荷密度高等優點。Liu 等使用帶正電荷的DMDAAC 接枝CMC 作為陰離子農藥的載體，具有多種環境響應功能，提高了農藥的利用效率。邱松發等利用乳液聚合把DMDAAC 和甲基丙烯酸甲酯的共聚物改性CMC，賦予農藥較強的緩釋性能，減少了農藥用量。

本文利用PDMDAAC對Zein進行改性，制備一種納米農藥載體，并負載了阿維菌素。利用FTIR、SEM、DLS 動態光散射激光粒度儀、zeta 電位儀和接觸角儀對納米顆粒進行了表征，分析了不同接枝量下AVM 的釋放情況，比較了原藥和納米農藥顆粒葉面上的滯留量，證明該納米農藥載體可以增強AVM的抗紫外性能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

玉米醇溶蛋白（Zein）、氫氧化鈉（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；二甲基二烯丙基氯化銨（DMDAAC），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿維菌素（AVM），工業級，純度為95%，河北威遠生物化工有限公司提供；溴化鉀，分析純，廣州化學試劑廠；濃鹽酸、過硫酸鉀（KPS）、無水乙醇，均為分析純，天津大茂化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計，T6 型，北京新世紀有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，Spectrum100型，美國賽默飛世爾科技公司；激光粒度儀，90 Puls型，英國馬爾文儀器有限公司；分析天平，SQP型，上海精科天美科學儀器有限公司；接觸角儀，Theat 型，瑞士百歐林儀器公司；旋轉蒸發儀，RV10型，德國艾卡公司。

1.3 聚二甲基二烯丙基氯化銨-玉米醇溶蛋白（Zein-g-PDMDAAC）的制備

2g玉米醇溶蛋白溶解在50mL 70%乙醇水溶液中。0.5g KPS溶于10mL去離子水，得到KPS溶液，取2mL 加入玉米醇溶蛋白溶液中攪拌5min；10mL 12%二甲基二烯丙基氯化銨溶液與剩余KPS溶液分別用恒壓滴定漏斗滴加至引發的玉米醇溶蛋白溶液中，在回流條件下繼續反應4h，反應全程通入氮氣保護。反應結束后旋轉蒸發除去乙醇，調節pH至13，離心取上清液，冷凍干燥得到Zein--PDMDAAC 產品，稱重。調整DMDAAC 的質量分數為12%、24%、36%，得到具有不同接枝率的產品 Zein--PDMDAAC-1、 Zein--PDMDAAC-2、Zein--PDMDAAC-3，具體見表1。合成機理如圖1所示。

表1 不同單體配比及接枝率

圖1 Zein-g-PDMDAAC合成示意圖

1.4 Zein-g-PDMDAAC@AVM的制備

AVM原藥溶解在無水乙醇中，制備10mg/mL的AVM乙醇溶液。分別取0.1g的Zein--PDMDAAC-1、Zein--PDMDAAC-2、Zein--PDMDAAC-3 溶 于3mL 70%乙醇水中，加入2mL AVM 乙醇溶液，將上述溶液加入95mL 去離子水的棕色錐形瓶中，攪拌30min得到Zein--PDMDAAC@AVM。

1.5 結構表征及性能測試

1.5.1 傅里葉紅外光譜（FTIR）

采用KBr壓片法，在450～4000cm光譜范圍內掃描，分辨率為2cm。

1.5.2 掃描電鏡（SEM）

將Zein--PDMDAAC 樣品置于樣品臺上，吹干，在固體樣品的表面噴金。在氮氣保護下，加速電壓為5kV時觀察其微觀結構。

1.5.3 粒徑和zeta電位

取去離子水釋至低濃度的Zein--PDMDAAC溶液于比色皿中，用動態光散射技術測定樣品的平均粒徑和zeta電位。

1.5.4 包封率測試

取4mL 新鮮制備的Zein--PDMDAAC@AVM于離心管中，12000r/min 離心10min。用移液槍移取1mL 上清液置于25mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。在波長為245nm 的紫外分光光度計下測定游離AVM 的吸光度。根據標準曲線公式=0.03037+0.00207（2=0.9997）計算AVM 的濃度，按式(1)計算對AVM的包封效率（，%）。

式中，為體系AVM 總質量，g；為體系中未包封的阿維菌素質量，g。

1.5.5 接觸角和葉面滯留量測試

配制2mg/mL的樣品溶液和AVM溶液，采用光學接觸角儀測量在黃瓜葉片上的接觸角。黃瓜葉片采摘后用去離子水沖洗干凈，放置干凈的玻片上晾干。用微量進樣器將不同樣品的溶液滴到葉子表面，記錄30s后的接觸角，每種樣品在葉片部位進行4次重復操作。

將沖洗后晾干的葉片裁成2cm×2cm，浸泡在樣品溶液15s后，用鑷子垂直提起至無液滴落下，放置分析天平稱重。滯留量（LHC）的計算如式(2)。

式中，和分別表示浸泡前后葉片的質量，mg；表示葉片的表面積，cm。

1.5.6 抗紫外性能測試

將 Zein--PDMDAAC@AVM 和 10mg/mL 的AVM乙醇溶液分別用去離子水稀釋至100mg/L。將50mL不同的樣品溶液（100mg/L）同時放置在距離紫外光光源15cm 的光化學反應器中，用300W 汞燈照射（=365nm）。在一定的時間內，移取1mL 樣品到棕色容量瓶中，用去離子水稀釋至10mL，并用紫外分光光度計測量245nm 處的吸光度。根據標準曲線公式=0.0317-0.00456（=0.998）算出AVM 的濃度，按式(3)計算對AVM 的殘留率（，%）。

式中，為AVM在溶液中的初始濃度；為不同光照時間后樣品中的AVM濃度。

1.5.7 緩釋性能測試

取Zein--PDMDAAC@AVM（5mL）于透析袋內并置于100mL 棕色錐形瓶。加入50mL40%乙醇水溶液作為釋放介質，錐形瓶置于26℃的搖床上。在一定的時間間隔內取1mL 緩釋液于棕色容量瓶中，用40%乙醇水溶液稀釋至10mL。同時，將等體積的釋放介質重新加入錐形瓶中，用紫外分光光度法在245nm處測定稀釋后的溶液的吸光度。按照標準曲線計算樣品在錐形瓶中的濃度，計算公式為=0.027348+0.00242（=0.9996）。然后根據式(4)計算AVM的累積釋放率（R，%）。

式中，C為每個樣品在不同時間間隔時AVM的濃度，mL；為錐形瓶中AVM的總質量，g。

2 結果與討論

2.1 傅里葉紅外光譜

如圖2 所示，Zein 的曲線在1660cm出現酰胺Ⅰ帶的吸收峰和1540cm處出現酰胺鍵Ⅱ帶的吸收峰，N—H 彎曲振動峰吸收和C—N 吸收拉伸振動峰都出現在1450cm處；在DMDAAC 的曲線中，1647cm和1008cm處分別為C==C 和C—N 的伸縮振動峰，960cm為C—H 的吸收峰，1476cm處為與N鍵合的兩個甲基的特征峰；在Zein--PDMDAAC的曲線中，與N鍵合的兩個甲基的特征峰出現在1480cm處，1540cm酰胺Ⅱ帶的吸收峰消失，說明PDMDAAC接枝成功。

圖2 Zein、DMDAAC和Zein-g-PDMDAAC的紅外光譜圖

2.2 掃描電鏡分析

疏水的Zein在親水的PDMDAAC改性后，在水中可通過自組裝方式形成球狀顆粒，如圖3(a)所示，Zein--PDMDAAC 呈圓形或橢圓形；使用Image-Pro Plus 軟件對顆粒粒徑進行計算，結果如圖3(b)所示，平均粒徑在85nm 左右。與DLS 粒徑有差異，可能是由于兩種技術所涉及的原理不同，納米顆粒在DLS 測量時分散在水中，而SEM 測試則處于一個干燥的狀態。

圖3 Zein-g-PDMDAAC的掃描電鏡圖及其粒徑分布圖

2.3 粒徑、zeta電位、包封率分析

如表2 所示，因為DMDAAC 帶正電荷，所以隨DMDAAC加入量增加，電荷值由(18.01±0.86)mV增大到(27.71±1.30)mV；Zein 是一種親水基團較少的蛋白，當加入的DMDAAC 量較少時，顆粒容易團聚，故Zein--PDMDAAC-1@AVM 的粒徑較大；顆粒所帶正電荷越多，顆粒間的靜電排斥力越強，穩定性越好，不易發生團聚，降低了顆粒大小；DMDAAC 具有交聯作用，隨著DMDAAC 加入量增加，其接枝率上升，顆粒的緊密程度也隨之增加，在水中的溶脹程度會較小，不利于捕獲AVM，故Zein--PDMDAAC-3@AVM的包封率也相對較低。

表2 不同DMDAAC添加量的Zein-g-PDMDAAC@AVM的粒徑、電位、包封率

2.4 接觸角分析

圖4 為水、 AVM 乙醇水溶液、 Zein--PDMDAAC@AVM 樣品在黃瓜葉片上的接觸角圖，水的接觸角大于90°，AVM乙醇水溶液的接觸角也接近90°，說明黃瓜葉片不能被兩者潤濕。Zein--PDMDAAC-1的接觸角比水的小，說明其能改變水的表面張力。隨著DMDAAC 添加量的增大，Zein-PDMDAAC 的接觸角由77.38°減小到64.60°，因為黃瓜葉面含有帶負電的脂肪醇和脂肪酸，Zein--PDMDAAC 電位的增大，與葉片的靜電作用力增強，故接觸角減小。

圖4 水(Ⅰ)、AVM乙醇水溶液(Ⅱ)、Zein-g-PDMDAAC-1@AVM(Ⅲ)、Zein-g-PDMDAAC-2@AVM(Ⅳ)、Zein-g-PDMDAAC-3@AVM(Ⅴ)在黃瓜葉片上的接觸角圖

2.5 葉面滯留

農藥在噴施的過程中，因作物表面的脂質層或蠟質層，農藥液滴易滾落會導致滯留量小。如圖5所示，黃瓜葉片上的滯留量結果和表面張力測試一致，Zein--PDMDAAC@AVM 比水的葉面滯留量明顯增大，其中Zein--PDMDAAC-3@AVM 的滯留 量 為33.69mg/cm。 一 方 面， 帶 正 電 荷 的PDMDAAC 與葉片存在靜電作用；另一方面，Zein--PDMDAAC-3 的粒徑小，比表面積大，進一步增強了與葉面的相互作用。因AVM 乙醇水溶液中含有乙醇，在葉片上的潤濕性較好，其葉面滯留量也會提高。

圖5 水(Ⅰ)、AVM乙醇水溶液(Ⅱ)、Zein-g-PDMDAAC-1@AVM(Ⅲ)、Zein-g-PDMDAAC-2@AVM(Ⅳ)、Zein-g-PDMDAAC-3@AVM(Ⅴ)在黃瓜葉片上的滯留量

2.6 抗紫外性能

殺蟲劑在應用于農作物時可能會受到強烈太陽光照射，所以開發抗紫外線的農藥制劑是必要的。如圖6 所示，在紫外燈照射下，未包封的AVM 降解率較高，在15min 左右已經降解一半，在70min 時最終剩余13.9%，而被Zein--PDMDAAC包封的AVM 的半衰期則從15min 延長到40min，Zein--PDMDAAC-1、 Zein--PDMDAAC-2 和Zein--PDMDAAC-3 的半衰期分別為40min、46min 和47min，在70min 時的剩余率都高于26.9%，明顯提高了AVM的抗紫外性能。這是因為Zein--PDMDAAC 為AVM 提供了一個物理屏障外殼，隔絕了紫外線的照射，Zein含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，這些氨基酸的單元中的芳香基團和雙鍵可以吸收紫外線，阻礙了AVM的降解。

圖6 未包封阿維菌素及不同配比的Zein-g-PDMDAAC@AVM的抗紫外圖

2.7 緩釋性能

圖7 為加入不同量的DMDAAC 的緩釋曲線。曲線的走勢可分為3個階段，從開始到第9h的釋放速率較快，因為部分黏附在Zein--PDMDAAC 顆粒表面的AVM 釋放到緩釋體系中；在第24h 時，Zein--PDMDAAC-1 的累積緩釋率為54%，Zein--PDMDAAC-2 和Zein--PDMDAAC-3 的 累積緩釋率相差不大，分別為67%和69%，因為單體的接枝量較大，親水組分比例上升，降低了顆粒內部的疏水作用，故其釋放速率較快；最后進入平臺期，累積緩釋率變化不大，Zein--PDMDAAC-1、Zein--PDMDAAC-2和Zein--PDMDAAC-3的最終緩釋率為57%、79%和75%。

圖7 不同配比的Zein-g-PDMDAAC@AVM的緩釋圖

2.8 緩釋動力學分析

為進一步研究樣品的釋放模式，采用Zeroorder、Higuchi、First-order 等動力學模型進行藥物緩釋數據擬合。結果如表3和圖8所示，用相關系數來確定各擬合曲線的適用性，其中First-order模型的相關程度最高，說明納米顆粒釋放AVM 是因為顆粒內部和外部的濃度差，First-order 公式的和分別表示藥物的最大釋放能力和持續釋放速率。

表3 模型擬合參數

圖8 不同pH下的緩釋擬合模型

3 結論

將PDMDAAC接枝玉米醇溶蛋白，制備了不同接枝量的阿維菌素納米顆粒。接枝量最高的Zein-PDMDAAC-3@AVM 的包封率為34.75%，zeta 電位值大，具有較好的穩定性；其接觸角為64.60°，滯留量為33.69mg/cm，提高了阿維菌素葉面沉積率；經Zein--PDMDAAC 納米顆粒包封后，AVM的半衰期從15min 延長到40min。納米顆粒的緩釋數據與First-order 相關性較高，受PDMDAAC 的接枝量調控。該阿維菌素納米顆粒具有良好的緩釋性能和環境友好性。