血清miR-23a、miR-30a與2型糖尿病合并骨質疏松的相關性

麥小青，陳邢玉，陳達健，宋科秀

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量低下、骨微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病。糖尿病是一種常見的全身代謝性內分泌疾病，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的90%以上。OP是T2DM的常見并發癥，有文獻報道，隨著T2DM患者壽命及病程的延長，T2DM合并OP的發病率呈增加趨勢[1]。T2DM合并OP是骨骼系統出現的嚴重慢性并發癥，也是引發持久功能障礙的主要因素，其發生骨折的風險顯著高于普通人群[2]。miR-23a與一些腫瘤的發生發展具有密切聯系。有研究證實，miR-23a能夠下調堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白基因的表達，參與調控骨代謝[3]。研究發現miR-30a在關節炎患者軟骨組織中呈高表達，且可靶向作用于Akt基因進而誘導軟骨細胞凋亡[4]。近年來相關研究報道，miR-23a、miR-30a分別在原發性痛風性關節炎及大鼠骨質疏松癥發展過程中起重要作用[5]。同時研究顯示，miR-30a與T2DM并重癥腎衰竭患者病情程度有關[6]。因此，本研究通過分析miR-23a、miR-30a與T2DM合并OP的相關性，以尋找診斷T2DM合并OP的相關生物學指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年10月—2019年10月于本院確診的T2DM 135例。納入標準：T2DM的診斷符合1999年WHO頒布的糖尿病診斷標準[7]；OP診斷符合1994年WHO制定的關于OP分類和診斷指南；臨床資料完整者；所有受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：長期營養缺乏、低鈣飲食者；近期服用影響骨代謝的藥物及其他代謝性骨病；合并腫瘤、血液系統、結締組織疾病者；合并心肝腎疾病者。將合并OP 70例作為OP組，未合并OP 65例作為無OP組；另選取未合并T2DM的OP 70例作為單純OP組，同期入院體檢的正常志愿者70例作為對照組。4組性別、年齡等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣本采集與保存：所有受試者于清晨空腹抽取靜脈血5 ml，3000 r/min離心5 min，離心半徑9 cm，分離血清，于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2qRT-PCR法檢測血清miR-23a、miR-30a水平:采用Trizol法提取血清中總RNA，操作步驟嚴格按照Trizol試劑盒說明書進行。應用反轉錄合成cDNA，反應體系：95 ℃預變性10 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火及延伸34 s，共40個循環。miR-23a、miR-30a均以U6作為內參，采用Folds=2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.2.3相關指標檢測：①采用雙光能X線骨密度儀(Challenger，DMS，France)檢測患者骨密度，按照操作要求準確輸入患者相關信息，按要求擺放體位，分別記錄大轉子區域、左側股骨頸及Wards三角區骨密度值，自動計算T值。②抽取禁食12 h后次日清晨空腹靜脈血，離心分離出血清待測，采用全自動生化分析儀測定血清空腹血糖(FBG)；采用全自動電化學發光免疫分析儀檢測骨鈣素(BGP)、β-膠原降解產物(β-CTX)水平，檢測試劑均購自瑞士羅氏公司，所有操作嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1血清miR-23a、miR-30a表達水平 OP組血清miR-23a、miR-30a水平高于對照組、單純OP組及無OP組(P<0.05)。見表1。

表1 4組血清miR-23a、miR-30a表達水平比較

2.2臨床指標 OP組大轉子、股骨頸、Wards三角區BMD及BGP、β-CTX均小于無OP組(P<0.01)。見表2。

表2 2組T2DM患者臨床指標比較

2.3血清miR-23a、miR-30a水平與臨床指標的相關性 血清miR-23a與miR-30a呈正相關(r=0.576，P<0.01)，與大轉子、股骨頸、Wards三角區BMD及BGP、β-CTX呈負相關(r=-0.381、-0.593、-0.533、-0.615、-0.582，P<0.05)；miR-30a與大轉子、股骨頸、Wards三角區BMD及BGP、β-CTX呈負相關(r=-0.428、-0.624、-0.583、-0.647、-0.560，P<0.05)。

2.4血清miR-23a、miR-30a對T2DM合并OP的診斷價值 血清miR-23a、miR-30a聯合診斷T2DM合并OP的AUC高于單獨檢測(P<0.05)。見表3。

表3 血清miR-23a、miR-30a對T2DM合并OP的診斷價值

2.5T2DM并發OP的危險因素多因素Logistic回歸分析 以T2DM患者是否發生OP作為因變量，以miR-23a、miR-30a、BGP、β-CTX為自變量進行非條件二分類Logistic回歸分析。根據ROC曲線確定的最佳截斷值將血清miR-23a、miR-30a分為高、低水平，變量賦值：miR-23a：低水平=0，高水平=1；miR-30a：低水平=0，高水平=1；大轉子BMD：正常=0，降低=1；股骨頸BMD：正常=0，降低=1；Wards三角區BMD：正常=0，降低=1；BGP：正常=0，降低=1；β-CTX：正常=0，降低=1。結果顯示，血清miR-23a、miR-30a水平升高為T2DM患者并發OP的危險因素(P<0.01)。見表4。

表4 T2DM并發OP的危險因素多因素Logistic回歸分析

3 討論

糖尿病是臨床常見的慢性代謝性疾病，常伴有微血管并發癥，影響患者血液循環及骨骼中的血流分布，可能導致骨組織供血不足，且患者多存在高糖及內分泌失調等癥狀，導致骨組織受損而引發骨代謝異常[8]。有研究顯示，T2DM患者發生OP風險高于普通人群，是骨質疏松性骨折發生的危險因素[9]。T2DM合并OP是致殘的重要原因之一，因此，T2DM合并OP的早發現早治療尤為重要[10]。

miR-23a能夠在轉錄后發揮調解作用[11]。已有研究證實，miR-23a參與包括神經系統、消化系統等多種癌癥的發生與發展[12]。此外miR-23a能夠調控細胞的正常生長和分化，有學者發現，miR-23在骨骼肌中的表達水平較高，其參與骨骼肌的發育過程[13]。miR-23a在細胞分化及骨代謝等相關方面已有一定的研究，但其與T2DM合并OP的關系研究較少[14]。本研究顯示，OP組血清miR-23a、miR-30a水平高于對照組、單純OP組及無OP組，提示miR-23a參與T2DM合并OP的發生，可能與miR-23a參與細胞的分化有關。在非小細胞肺癌組織中，miR-30a表達下降，起到抑癌基因作用，能夠抑制癌細胞的轉移。有研究發現，miR-23a與miR-30a在炎癥環境下牙周骨組織中表達上調，提示miR-23a與miR-30a參與調控炎癥環境下骨代謝和成骨細胞活性[15]。在細胞分化和發展過程中，骨關節炎患者miR-30a表達上調，通過靶向調節Sox9和下游產物促進細胞外基質的降解。miR-30a參與細胞的分化過程，且與骨代謝等關系密切，但與T2DM患者并發OP的關系研究較少。本研究結果顯示，T2DM合并OP患者血清miR-30a表達上調，提示miR-30a參與T2DM合并OP的發生，推測miR-30a可能作用于T2DM患者細胞成骨分化的過程，從而參與到成骨細胞分化的多種生長因子的調控，與T2DM合并OP的發生有關，而與單純OP的發生無關。分析原因可能是臨床影響因素較多，如樣本量偏小可能導致結果有一定偏倚，為深入分析miR-30a與骨代謝的具體作用機制還應在大樣本基礎上繼續探究。

BGP為成骨細胞產生的特異性蛋白，能夠募集、趨化并激活破骨細胞，調節骨吸收。β-CTX是最穩定的骨吸收標志物，且敏感度較高。本研究結果顯示，T2DM合并OP患者大轉子、股骨頸、Wards三角區BMD及BGP、β-CTX均低于未合并OP患者，且miR-23a、miR-30a均與大轉子、股骨頸、Wards三角區BMD及BGP、β-CTX呈負相關，miR-23a與miR-30a呈正相關，提示血清miR-23a、miR-30a參與T2DM合并OP的發展，且與患者臨床病理特征密切相關。本研究結果顯示，miR-23a和miR-30a聯合診斷T2DM合并OP的敏感度、特異度均較高。提示miR-23a、miR-30a二者聯合檢測對T2DM并發OP具有一定診斷價值，能夠作為診斷T2DM并發OP的潛在生物學指標。多因素Logistic回歸分析結果顯示，miR-23a、miR-30a為T2DM患者并發OP的危險因素，提示血清miR-23a、miR-30a高表達可能造成T2DM患者骨骼分化能力減弱，從而導致骨密度降低，最終致OP的發生。

綜上所述，T2DM合并OP患者血清miR-23a、miR-30a水平上調，與T2DM合并OP患者骨密度等臨床指標相關，是T2DM合并OP獨立危險因素，二者聯合檢測對T2DM合并OP有一定診斷價值。