EMIT法檢測他克莫司全血藥物濃度樣品穩定性探討

沈陳軍 閔芳芳 寧 萍 安徽省滁州市第一人民醫院 藥劑科 心胸外科 39000

他克莫司又叫FK506，是一種結構為大環內酯類的免疫抑制劑，臨床上主要用于器官移植術后的抗排異治療，同時在腎病、風濕及免疫調節方面也有應用[1-3]。由于他克莫司是一種治療指數窄、副作用明顯的藥物，其療效、毒性與藥物在體內的濃度密切相關，根據臨床指南等要求腎移植術后患者需要監測他克莫司全血藥物濃度，并根據血藥濃度調整劑量[4-5]。目前檢測他克莫司全血藥物濃度的方法主要有色譜法和免疫法，其中免疫法應用較多[6]。我院使用西門子Syva生化分析儀的酶放大免疫分析法(EMIT)進行檢測，由于我院有較多院區，因此檢測需要固定地點和集中時間，對此患者可能會對樣品是否及時檢測和檢測結果準確性有一定疑慮。綜合以上原因，現對患者他克莫司血樣在不同時間和溫度的存儲條件下進行結果檢測，以探討其穩定性。

1 材料與方法

1.1 儀器 Viva-E全自動生化分析儀(ELITech Group B.V.)、移液器(大龍興創實驗儀器股份公司)、XW-80A漩渦混合器(上海精科實業有限公司)、TG16-W高速離心機(長沙維爾康湘鷹離心機有限公司)、DW-40L92海爾醫用低溫保存箱(青島海爾生物醫療股份有限公司)、BCD-180R榮事達冷藏冷凍冰箱(榮事達三洋電器股份有限公司)。

1.2 試劑 他克莫司檢測試劑包括抗體試劑1、緩沖試劑2、酶試劑3(美國西門子醫學診斷股份有限公司，批號：8R019UL-N2)、他克莫司定標液(美國西門子醫學診斷股份有限公司，批號：8R109UL-M3)、他克莫司質控品(More Diagnostics inc.，批號：290-7310)、樣本萃取液(美國西門子醫學診斷股份有限公司，批號：8S079UL-L1)、甲醇為色譜純(南京化學試劑股份有限公司，批號：180320919D)。

1.3 方法

1.3.1 實驗條件與分組：選取6名患者長期服用(半年以上)他克莫司藥物，年齡25～60歲患者的血樣，經EDTA抗凝后取200μl分別保存在室溫(24℃±1℃)立刻檢測(0h)、1天(1d)、3天(3d)、5天(5d)和冷藏(5℃±1℃)1周(1w)、2周(2w)和3周(3w)，后采用酶放大免疫分析法(EMIT)對以上樣品進行檢測。另對0h檢測結束后的前處理樣品上清液分別室溫放置15min和30min后再次檢測。同時每次檢測時隨行質控品測定。

1.3.2 全血藥物濃度前處理方法：將EDTA抗凝后選取的200μl血樣輕微混勻后分別依次加入200μl甲醇和50μl樣本萃取液，立即充分振蕩勻混，混勻結束后靜置2min，隨后立即14 000r/min高速離心5min，離心結束后立即將上清液取出上機檢測。

1.4 統計學方法 以上檢測結果數據錄入Excel 2007，以0h檢測結果作為基準數據，與室溫、冷藏和靜置后條件下的檢測結果進行比較，數據采用雙側配對t檢驗，使用SPSS21.0統計軟件進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同存儲溫度和時間后樣品檢測結果 EMIT法分別檢測6名服用他克莫司藥物患者血樣，不同溫度和存儲時間后檢測結果出現明顯改變。樣品室溫0h、1d、3d、5d，范圍RSD 7.00%～20.00%，平均RSD=11.91%，冷藏0h、1w、2w、3w檢測結果RSD范圍6.00%～17.00%，平均RSD=11.42%。前處理后室溫放置15min和30min后檢測結果RSD范圍5.00%～16.00%，平均RSD=10.50%。具體檢測值詳見表1。

表1 不同存儲溫度和放置時間后樣品檢測結果情況

將室溫1d、3d、5d檢測結果與0h檢測結果分別進行雙側配對t檢驗，P1d=0.713，P3d=0.415，P5d=0.909，P值均>0.05，差異無統計學意義。冷藏1w、2w、3w檢測結果與0h檢測結果分別進行雙側配對t檢驗，P1w=0.962，P2w=0.813，P3w=0.465，P值均>0.05，差異無統計學意義。前處理后室溫放置15min和30min后檢測結果與0h檢測結果分別進行雙側配對t檢驗，P15min=0.542，P30min=0.005，P30min<0.05，差異有統計學意義。

2.2 不同存儲溫度和時間樣品比較結果 比較0h檢測結果與室溫、冷藏和前處理后靜置不同時間檢測結果差值的絕對值，在室溫保存條件下1d、3d、5d檢測結果均有波動，放置1d時相對波動較小，3d和5d結果波動較大。冷藏放置1w和2w時相對波動較小，3w時結果波動較大。前處理后上清液分別室溫靜置15min和30min再次檢測結果有波動，且結果整體有增大趨勢。詳見表2。

表2 不同存儲溫度和放置時間后樣品檢測結果比較

3 討論

3.1 不同存儲溫度和時間對他克莫司檢測結果的影響 以上實驗結果可以表明，檢測他克莫司全血藥物濃度樣品室溫(24℃±1℃)和冷藏(5℃±1℃)條件下分別可以保存1d和1w，長時間室溫或者冷藏保存可能導致結果的波動，影響檢測結果的準確性。我院目前血藥濃度檢測地點為北院區，南院區收取血樣后及時保存在冰箱冷藏，當天通過冷藏冰袋保存轉運至北區檢測，其結果不會引起偏差。因此臨床醫生或患者不必擔心檢測結果的準確性。有文獻報道建議他克莫司血樣室溫保存不超過24h，冷藏條件下不超過48h，且避光密封保存可進一步減少影響[7]。全血樣品前處理后得到的上清液應立即上機檢測，保存時間不要超過15min，根據測算同批次上機檢測樣品不要超過30個，否則可能因上清液中甲醇長時間暴露在空氣中引起揮發，導致檢測結果偏大。如果檢測樣品過多，離心后EP管應密封保存，當上機檢測時再倒出上清液。目前我院使用的是EMIT法西門子全自動生化分析儀，他克莫司全血藥物濃度樣品檢測時每批次同時進行質控品檢測，且根據質控結果情況定期制定標準曲線，盡可能保證檢測結果的準確。

3.2 影響他克莫司檢測樣品穩定性的原因分析 他克莫司是一種來源于真菌的大環內酯類抗生素，具有選擇性T淋巴細胞鈣調神經磷酸酶抑制作用，是臨床常用的繼環孢素后另一種免疫抑制劑。由于他克莫司的治療范圍窄，劑量與療效和副作用相關性明顯，因此需要服用他克莫司的患者定期監測其血藥濃度。EMIT法原理是以競爭結合他克莫司抗體的結合位點為基礎，樣品中他克莫司與酶試劑中的標記的重組酶葡萄糖-6磷酸脫氫酶他克莫司發生競爭[7]。根據不同溫度存儲條件下他克莫司樣品檢測結果可以看出室溫保存與冷藏保存整體檢測結果經統計檢驗后比較差異雖無統計學意義，但仍可以看出冷藏保存的整體檢測結果RSD值和平均變化幅度均小于室溫保存。因此可以得出溫度對他克莫司樣品保存后檢測結果具有顯著的影響[8-9]。他克莫司在血液中主要結合在紅細胞上，且他克莫司在全血與血漿中濃度的比例約為20∶1，血漿中他克莫司與血漿蛋白結合率高達98.8%[10]。由于免疫法檢測他克莫司全血藥物濃度影響因素較多[11]，例如紅細胞功能、紅細胞壓積、內源性物質、他克莫司代謝產物以及其他可能產生影響的藥物等，且溫度對以上因素具有顯著影響。具體原因可能是較高溫度時加速紅細胞的代謝，導致他克莫司自身降解，同時血漿游離他克莫司與血漿蛋白結合增加，紅細胞破壞影響紅細胞壓積，最終多種因素導致他克莫司全血藥物濃度檢測結果的波動[7,12-13]。

3.3 本研究的不足及其他相關問題 由于EMIT法檢測他克莫司的試劑較昂貴，單個樣品檢測需要次數較多，導致實驗成本較大，故本次研究選取的樣本量較少。在他克莫司檢測過程中，環境和人員操作對實驗結果也有一定影響[14-15]。由于溫度對酶反應過程中具有決定作用，因此實驗室溫度在檢測過程中應該按要求嚴格控制在24℃左右。實驗時發現，當實驗室溫度不穩定或低于24℃時，可能由于酶反應不足，導致結果偏低的情況。同時濕度以及光線對樣品穩定性的影響情況還需要后續實驗繼續探討。他克莫司在前處理過程中用于提取處理的EP管體積常用有1.5ml和2ml，經過多次試驗發現1.5ml EP管底部為尖頭，如果操作時先吸取血樣，再加入甲醇和樣本萃取液，可能出現中下部瞬間沉淀凝結而底部血樣難以混勻，因此為避免前處理操作誤差，建議使用2ml底部圓形的EP管，可以極大避免以上情況的出現。全血樣本應使用EDTA抗凝采血管，不建議使用肝素抗凝，因為有可能在實驗過程中出現小血凝塊，影響檢測結果。因此綜合以上情況必須做好室內質量控制，保證檢測結果的穩定與準確。

綜上所述，EMIT法用于臨床檢測他克莫司全血藥物濃度具有簡便快捷、自動化程度高等優點，適合急診以及大樣本檢測，但試劑成本較高且實驗過程及樣品受溫濕度等環境影響較大。樣品的存儲溫度和時間對檢測結果的影響較大，應盡量做到及時處理檢測，或短時間冷藏后檢測，樣品前處理后上清液應立即上機檢測，且同批上機檢測樣品不能超過30例，否則可能影響檢測結果。