過表達miR-411對宮頸癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

唐亮 陰敏 張海 肖燕 馬瑩瑩

宮頸癌是女性生殖系統發病率較高的惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康，盡管隨著手術、放化療及靶向治療等綜合治療的進步，宮頸癌診療有所改善，但對于晚期宮頸癌預后仍然很差[1]。宮頸癌發病機制復雜，涉及抑癌基因失活、癌基因激活等，因此，尋找影響宮頸癌發生發展機制有重要意義。越來越多研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)與宮頸癌發生發展密切相關[2]。miRNA是一類內源基因編碼的非編碼RNA，長度約18-25nt，不翻譯蛋白，可通過與靶基因mRNA的3’UTR結合，抑制靶基因翻譯，從而在轉錄及轉錄后水平影響多種細胞功能[3]。在腫瘤中，miRNA可發揮癌基因或抑癌基因樣作用，與腫瘤發生發展及轉移等密切相關[4]。miR-411定位于染色體14q32，目前在肺癌、腎癌等腫瘤中有研究[5,6]，miR-411在宮頸癌中研究較少。有研究顯示，miR-411可通過靶向STAT3抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲能力[7]，但miR-411對宮頸癌細胞凋亡及機制研究尚未明確。因此，本研究旨在miR-411對宮頸癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM培養基、胰酶、胎牛血清、Opti-MEM培養基均購自美國Gibco；Trizol、LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen；miR-411 mimics及miR-NC、miR-411 inhibitor及anti-miR-NC、PIK3R3 siRNA及陰性對照siRNA、PIK3R3過表達載體及空載體均購自蘇州吉瑪生物制劑有限公司；MTT及DMSO均購自美國Sigma；Transwell小室、Matrigel膠、流式細胞儀均購自美國BD；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒均購自中國碧云天；PIK3R3、PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3均購自美國Abcam；酶標儀、RT-PCR儀均購自美國Thermo公司。

1.2 細胞及培養 宮頸癌Caski、SiHa和C-33A細胞及正常宮頸上皮永生化細胞End1/E6E7均購自美國ATCC。所有細胞使用含10% FBS的DMEM完全培養基培養，培養條件為5%體積分數CO2、37℃培養箱。觀察到細胞覆蓋瓶底80%～90%面積時，胰酶消化、傳代。傳代后每2天換液1次。選擇對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞轉染 收集、計數對數生長期的SiHa細胞，以2×105個/孔接種于6孔板，放置于5%體積分數CO2、37℃培養箱培養。當細胞達70%～80%融合度時可進行轉染。參照LipofectamineTM2000轉染說明，使用Opti-MEM培養基分別稀釋Lipo 2000、miR-411 mimics及miR-NC、miR-411 inhibitor及anti-miR-NC、PIK3R3 siRNA(si-PIK3R3)及陰性對照siRNA(si-NC)、PIK3R3過表達載體(pcDNA-PIK3R3)及空載體(pcDNA)請提供相關圖片與數據。將稀釋后的各組細胞與Lipo 2000充分混勻，室溫條件下放置5 min，加入至6孔板相應孔內，放置于培養箱進行轉染反應，6 h 后，更換為完全培養基繼續培養。

1.4 qRT-PCR檢測miR-411和PIK3R3表達 收集轉染miR-411 mimics及PIK3R3 siRNA 48 h的SiHa細胞。Trizol法提取細胞總RNA，NanoDrop檢測RNA樣品濃度，選擇符合要求的RNA逆轉錄為cDNA，加入SYBR green染色，設置5個復孔，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR擴增。引物由上海生工合成，miR-411基因上下游引物分別為：5’-GGGGTAGTAGACCGTATAG-3’，5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；U6基因上下游引物分別為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’ ；PIK3R3基因上下游引物分別為：5’-CTTGCTCTGTGGTGGCCGAT-3’，5’-GACGTTGAGGGA GTCGTTGT-3’；GAPDH基因上下游引物分別為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。通過2-△△Ct法計算miR-411和PIK3R3 mRNA表達水平。實驗重復3次。

1.5 MTT檢測細胞增殖 以5 000個/孔接種對數生長期的SiHa細胞于96孔板，常規培養24 h，待細胞貼壁，按照1.3方法進行轉染，每組設置5個復孔。轉染48 h，收集細胞，每孔加20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h。棄掉上清，以150 μl/孔加DMSO溶液，混勻。酶標儀測定490 nm波長各孔的光密度值(OD值)。實驗重復3次。

1.6 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 Transwell小室濾膜(8 μm孔徑)中添加50 μl的Matrigel混合液(Matrigel膠∶培養基=1∶6)，使混合液完全覆蓋濾膜，放置在37℃培養箱孵育2 h使Matrigel凝固。待Matrigel凝固后，在Transwell小室上室加100 μl無血清培養基，下室加600 μl無血清培養基，37℃平衡過夜。胰酶消化轉染48 h的各組細胞，PBS漂洗2次，計數。取1×105個細胞，100 μl無血清培養基重懸，后將細胞懸液添加至小室上室，下室加500 μl完全培養基。小室放置于培養箱常規孵育48 h，拭掉上室細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色10 min，PBS洗滌2次。顯微鏡下隨機選擇5個視野，觀察穿過膜的細胞數，拍照，統計數量。實驗重復3次。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 依據細胞凋亡試劑盒說明，胰酶消化轉染48 h的各組細胞，調整細胞濃度為5×105個/ml，預冷PBS洗滌細胞，結合緩沖液重懸細胞。取100 μl細胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光室溫孵育15～20 min，加400 μl結合緩沖液，1 h內流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗 構建含miR-411和PIK3R3結合位點的PIK3R3野生型及突變型3’UTR 報告質粒，命名為WT和MUT。接種SiHa細胞于24孔板，密度為5×104個/孔，放置于培養箱常規培養，細胞達80%融合時，將WT/MUT的PIK3R3 3’UTR質粒分別與miR-411 mimics和miR-NC共轉染至SiHa細胞，轉染參照Lipofectamine 2000說明，每組設置3個重復孔。轉染48 h，檢測各組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.9 Western blotting檢測PIK3R3、PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3表達 收集轉染miR-411 mimics/inhibitor 48 h的SiHa細胞，離心，在細胞沉淀中加適量RIPA裂解液，混勻，室溫在冰上放置30 min，4℃離心，收集上清，總蛋白在上清液中。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。在蛋白中添加5×上樣緩沖液，100℃水浴10 min，離心，收集上清。凝膠上樣孔加40 μg蛋白，每孔等量蛋白，電泳后轉PVDF膜，轉好的膜放置在TBST液中清洗5 min，室溫條件將膜放置在5%脫脂奶粉中封閉1 h，TBST洗膜。膜放到經封閉液稀釋的一抗中，4℃孵育過夜。TBST洗膜。膜放到經封閉液稀釋的HRP標記的二抗中，室溫孵育2 h。TBST洗膜，吸干膜上水分，在膜含蛋白面滴加ECL反應液，暗室內2 min，膜用保鮮膜覆蓋，暗室內顯影。Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。實驗重復3次。

2 結果

2.1 miR-411在宮頸癌細胞表達 qRT-PCR檢測miR-411在不同宮頸癌細胞表達，結果顯示，miR-411在Caski、SiHa和C-33A細胞表達均明顯低于在End1/E6E7細胞表達(P<0.05)。選擇表達最低的SiHa細胞作為研究對象。見表1。

表1 miR-411在宮頸癌Caski、Sika和C-33A細胞表達

2.2 miR-411可靶向調節PIK3R3表達 miR-411的5’UTR與PIK3R3的3’UTR存在7個連續的結合位點。雙熒光素酶檢測結果顯示，miR-411 mimics與PIK3R3野生型質粒共轉染，熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與PIK3R3突變型質粒共轉染，熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。miR-411 mimics可明顯抑制PIK3R3表達，而miR-411 inhibitor可明顯促進PIK3R3表達(P<0.05)。提示miR-411和PIK3R3存在靶向關系，miR-411可負調控PIK3R3表達。見表2，圖1。

表2 2組細胞熒光素酶活性

2.3 過表達miR-411對SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 miR-411 mimics轉染SiHa細胞48 h，miR-411表達明顯升高(P<0.05)。說明過表達miR-411的SiHa細胞建立成功。細胞增殖、侵襲和凋亡檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-411 mimics組細胞OD值明顯降低，細胞侵襲數明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 過表達miR-411對SiHa細胞增殖、侵襲(A，×200)和凋亡(B)的影響

表3 過表達miR-411對SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡影響

2.4 抑制PIK3R3表達對SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-PIK3R3組PIK3R3表達明顯降低，細胞增殖及侵襲能力明顯降低，凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 抑制PIK3R3表達對SiHa細胞增殖、侵襲(A,×200)和凋亡(B)影響

表4 抑制PIK3R3表達對SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡影響

2.5 過表達PIK3R3可逆轉miR-411對SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡影響 各組細胞增殖、細胞侵襲數及細胞凋亡率檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-411 mimics組和miR-411 mimics+pcDNA組細胞增殖和細胞侵襲數明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與miR-411 mimics+pcDNA組比較，miR-411 mimics+pcDNA-PIK3R3組細胞增殖和細胞侵襲數明顯升高，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 過表達PIK3R3可逆轉miR-411對SiHa細胞增殖、侵襲(A,×200)和凋亡(B)影響

表5 5轉染細胞OD值、細胞侵襲數及細胞凋亡率

2.6 過表達miR-411對PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-411 mimics組PI3K、p-AKT和PCNA表達均明顯降低(P<0.05)， E-cadherin和cleaved caspase3表達均明顯升高(P<0.05)；與miR-411 mimics+pcDNA組比較，miR-411 mimics+pcDNA-PIK3R3組PI3K、p-AKT和PCNA表達均明顯升高(P<0.05)， E-cadherin和cleaved caspase3表達均明顯降低(P<0.05)。見表6，圖5。

表6 4組細胞PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3蛋白相對表達量

3 討論

作為一類非編碼RNA，miRNA可通過調節靶基因表達，從而參與細胞死亡、細胞分化、細胞代謝等多個生理過程。已有研究表明，miRNA與心血管疾病、癌癥、糖尿病等多種人類疾病密切相關[8-10]。有研究顯示，宮頸癌可引起miRNA表達失調，如Pereira等[11]通過對miRNA表達譜分析，發現在宮頸鱗癌組織中有31個異常表達的miRNA，這些miRNA可作為宮頸鱗癌診療標志物。已有多項研究表明，miR-411與腫瘤生長有關，如Zhang等[12]研究顯示，過表達miR-411可抑制腎癌細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡。Chen等[13]研究顯示，miR-411可通過調節DSLC27A2影響卵巢癌化療敏感性。Zhang等[14]研究顯示，miR-411-5p可通過靶向GRB2抑制乳腺癌細胞增殖和轉移。本研究檢測結果顯示，miR-411在乳腺癌細胞表達明顯降低，過表達miR-411可明顯抑制SiHa細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，其中的細胞增殖和侵襲結果與既往研究結果[7]一致。

磷脂酰肌醇-3激酶調節亞基3(PIK3R3)是PI3K重要的調節亞基，已有研究報道其在包括宮頸癌在內的多種腫瘤中高表達，其表達有促進腫瘤增殖、轉移及化療抵抗等功效[15,16]。有研究顯示，miR-212可靶向PIK3R3抑制結直腸癌細胞的活力和侵襲能力[17]；miR-511可靶向PIK3R3抑制肝癌細胞生長和轉移[18]。也有研究表明，miR-411可靶向PIK3R3抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲，并促進細胞凋亡[19]。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗及miR-411mimics/inhibitor對PIK3R3表達影響，證明miR-411可靶向負調控PIK3R3表達。抑制PIK3R3表達可明顯降低SiHa細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，而過表達PIK3R3可減弱miR-411對細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。提示miR-411可靶向抑制PIK3R3抑制宮頸癌細胞生長。

PI3K/AKT信號通路是一條與腫瘤發生發展密切相關的信號途徑，在包括宮頸癌在內的多種腫瘤中被激活[20,21]，研究表明，抑制該信號通路是有效的抗腫瘤手段[22]。AKT是PI3K的下游分子，其活化后可通過調節PCNA、E-cadherin、caspase3等基因表達，從而影響細胞的生長、增殖等過程[23]。PCNA與DNA合成密切相關，其表達高低可反映細胞增殖狀態，有研究顯示，PIK3R3可通過其NH2末端與RBI和PCNA互作，從而發揮癌基因功能。上皮間質轉化(EMT)是引起惡性腫瘤發生遠處轉移的關鍵步驟，E-cadherin是EMT的標志蛋白，有研究顯示，PIK3R3可通過ZEB1介導的EMT促進胰腺癌轉移[24]。caspase3是凋亡相關的caspase家族關鍵酶，其活化可促進細胞凋亡[25]。本研究結果顯示，過表達miR-411可抑制PI3K、p-AKT和PCNA表達，促進 E-cadherin和cleaved caspase3表達；而過表達PIK3R3可逆轉miR-411對PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3表達的影響。有研究顯示，miR-365可靶向PIK3R3抑制AKT/mTOR信號通路，從而降低膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力[26]。提示miR-411可靶向PIK3R3抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制宮頸癌細胞生長。

綜上所述，miR-411在宮頸癌細胞低表達，過表達miR-411可抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，提示miR-411/PIK3R3在宮頸癌發病中有一定作用，有望成為宮頸癌治療的潛在靶點。