呼吸道感染患兒EBV-DNA載量及與肝腎功能損傷的關系

崔佳麗 張巨平 劉秀珍

愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)主要經由呼吸道傳染，入體后，可直接侵犯機體免疫系統而發生免疫反應，并會累及全身若干器官和系統，相應的臨床表現也復雜多樣，給診斷、治療造成較大障礙[1]。近年感染EBV的兒童有逐年增多的趨勢，且有數據顯示<4歲的兒童易感率尤其高[2]。EBV感染后的疾病發生率中，呼吸道疾病最多，研究顯示，EBV感染后的肝腎損傷概率也很高，但此種肝腎損傷并無易查的、特異性的臨床表現，而易被漏診、誤診[3,4]。所以，EBV感染后如能盡早檢查出肝腎功能是否損傷，對于保護患兒肝腎臟器功能，有效控制疾病，改善患者預后極其重要。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)是公認的反映機體內肝細胞損傷程度及肝組織炎癥變化情況的指標，在臨床也是篩查、診斷和鑒別肝臟疾病的敏感、有效指標[2，5,6]；同樣，胱抑素 C(CysC)、β2微球蛋白(β2-MG)是目前臨床用于評估腎功能適用性較高的參考指標[7,8]。目前，病毒DNA載量檢測是對患者體內病毒進行檢測的較為先進的方式，因其可較為科興、直觀地反映病毒感染狀況[9]。目前有關于EBV-DNA載量與呼吸道感染患兒肝腎功能損害關系的研究較少，因此本研究比較了不同性別、不同年齡組患兒的EBV-DNA陽性率，同時分析EBV-DNA與肝腎功能指標水平的關系，旨在為EBV呼吸道感染患兒肝腎損傷的評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2020年12月河北省邯鄲市中心醫院門診及住院治療且經臨床確診的175例呼吸道感染兒童，其中男98例，女77例；年齡5個月～10歲，平均年齡(4.21±1.31)歲，<1歲39例，1～3歲41例，4～6歲69例，>6歲26例。其中亦發現肝功能異常46例，腎功能異常37例。根據的EBV-DNA載量水平將所收集患兒分為陽性組(EBV-DNA>5.00E+3,n=117)和陰性組(EBV-DNA≤5.00E+3,n=58)；此外，陽性組依據EBV-DNA載量水平不同分為3個亞組：低載量組(5.00E+35.00E+5,n=21)。本研究符合倫理學規范，已通過醫院相關審批。

1.2 納入標準[10](1)患兒均經我院首診為EBV感染，中途未轉院、未經其他途徑治療；(2)呼吸道感染診斷標準：發熱(體溫≥38℃)，并伴有咳嗽、咳痰、咽喉疼痛、乏力或全身酸痛等；(3)患兒無其他影響本研究的哮喘、肺結核等肺部疾病及惡性腫瘤；(4)患兒監護人充分了解并自愿參與本研究。

1.3 排除標準 (1)伴哮喘、肺結核等其他對本研究有影響的呼吸系統疾病的患兒；(2)中途轉院；(3)近期內有服用影響肝腎功能藥物史；(4)近期內應用過免疫抑制劑；(5)患有其他肝腎疾病；(6)患兒監護人不愿意參與本研究。

1.4 收集標本 患兒于入院24 h內采集外周血3 ml，以3 000 r/min，離心10 min后取上清液，放于-30℃冰箱中保存待測。

1.5 EBV-DNA 的提取 采用瑞士羅氏公司生產的cobas z480全自動熒光定量PCR分析儀及其配套試劑檢測血清中EBV-DNA載量，血清中加入1 ml Trizol 溶液,抽吸均勻后按照試劑說明書操作。于含有 DNA 的 Trizol 溶液中加入 300 μl 純乙醇。顛倒混勻，4℃離心 5 min，轉速：2 000 r/min。去上清，向剩余的 DNA 沉淀中加入含 0.1mol檸檬酸鈉的 10%乙醇1.5 ml，室溫下旋轉放置 30 min。4℃下離心 5 min，轉速：2 000 r/min，去上清，以 0.1 mol檸檬酸鈉的 10%乙醇溶液重復洗滌一遍。給樣本中加入 75%乙醇溶液 1.5 ml，室溫下旋轉放置 20 min。后4℃下離心 5 min，轉速：2 000 r/min，去上清，室溫干燥約30 min。于管中加入 8 mmol氫氧化鈉 300 μl，4℃過夜。12 000 r/min離心 10 min，取上清入一新管，加入 30 μl 0.1 mol的 HEPES (Molecular Research Center公司，美國)。取 DNA 2 μl 加入 98 μl 超純水中，進行分光光度儀檢測，以超純水作為空白對照。配制擴增體系20 μl/份，將上述DNA 25 μl溶液加入反應體系；瞬時離心15 s，震蕩混勻10 s，再進行瞬時離心15 s后轉移至擴增檢測區上機檢測。

1.6 生化指標檢驗 采用日本日立公司生產的7170全自動生化分析儀及其配套試劑檢測血清ALT、AST、CysC、β2-MG水平，檢測嚴格遵守試劑盒和儀器操作規程進行。

2 結果

2.1 不同年齡、不同性別患兒EBV-DNA載量水平 男、女患兒EBV-DNA 峰值載量陽性率(31.63% vs 35.06%)比較差異無統計學意義(P>0.05)。不同年齡段(<1歲，1～3歲，4～6歲，>6歲)患兒EBV-DNA峰值載量陽性率(61.54% vs 75.61% vs 79.71% vs 26.92%)比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同年齡、性別EBV-DNA 峰值載量比較 例(%)

2.2 EBV-DNA不同載量組間肝腎功能異常情況 EBV-DNA陰性組肝腎功能異常患者的構成比例(3.44%和1.72%)低于低載量組(19.67%和13.11%)、中載量組(48.57%和34.28%)和高載量組(66.66%和66.66%)(P<0.05)；低載量組低于中載量組、高載量組(P<0.05)；中載量組低于高載量組(P<0.05)。見表2。

表2 不同EBV-DNA分組與肝腎功能異常的關系 例(%)

2.3 EBV-DNA不同載量組患兒肝腎功能指標水平比較 陰性組患兒血清ALT、AST、CysC、β2-MG水平低于EBV-DNA低載量組、中載量組、高載量組(P<0.05)；低載量組低于中載量組、高載量組(P<0.05)；中載量組低于高載量組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 EBV-DNA不同載量患兒肝腎功能相關指標水平比較

2.4 EBV-DNA 載量與肝腎功能指標水平的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，EBV-DNA 載量與血清ALT、AST水平呈正相關(r=0.683，P=0.022；r=0.759，P=0.010)，EBV-DNA 載量與血清CysC、β2-MG水平呈正相關(r=0.649，P=0.026；r=0.743，P=0.017)。

3 討論

EBV感染在一年四季中均會發病，但以晚秋至初春時節較多；該感染可以發生于世界各地，且多呈散發，在小范圍內可呈流行狀態[8-10]。有研究發現，在發展中國家內，EBV初次感染患者的年齡段以嬰幼兒為主,在發達國家則以青少年階段為主[3,4];另有數據顯示，EBV 患者初次感染的年齡段和感染率在不同種族、不同社會階層及不同家庭間也存在較大差異[4,7]。普通人群對EBV的易感性較高，而其在人群中的血清學檢測陽性率有可能達到90%[11]。

本研究中175例感染EB病毒的患兒中男性例數為98例、EBV-DNA陰性為31例，陽性為67例，女性例數77例，陰性27例，陽性50例，各組性別構成均是男性高于女性，但是差異無統計學意義(P>0.05)。而不同年齡階段患兒陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，1～6歲為高發年齡，這與既往研究數據顯示我國 EB 病毒感染患者的高發年齡在3～5歲，并且感染率可高達90%[12]一致。

EB病毒大多情況下經由呼吸道傳播,到達患兒口咽部后，在其上皮細胞中增殖后釋放,侵襲局部淋巴組織中的B細胞后進行感染,而正常情況下，B細胞進入人體血液后會引發全身性的EB 病毒感染癥狀[13]。EB病毒一般會在宿主細胞內長期潛伏，因它的噬B細胞特性,若此時碰到的受體細胞具有內吞作用時，那么EB病毒就會以這種方式非常容易地進入到被感染細胞中[14]；一旦有細胞被感染，B細胞抗原也會隨之改變，然后激活T細胞，將其轉化成有細胞毒性的效應T細胞，最終達到引起相應組織損傷的目的。在以往的研究中發現，EBV病毒可以將B細胞、T細胞、NK細胞、單核巨噬細胞等感染,另外EBV編碼抗原中的VCA、EBNAs等，也能對T細胞發揮激活的作用[15]。

嚴格來講，EB病毒只是一種皰疹病毒,也是一種非嗜肝病毒,其在臨床上較易造成兒童肝臟損傷，發生肝功能損傷的患兒主要病理表現為細胞的凋亡[16]。肝功能出現損傷時，表現為肝細胞再生能力減弱,進而會影響患者機體的基礎代謝水平和蛋白質合成或降解進程,直接導致肝臟儲備功能降低。相關的研究結果顯示,EB病毒感染時，可連帶促進與機體免疫相關的因子發生增殖反應,導致患者的機體各臟器功能均有損傷[17]。另一方面，EB病毒感染時，亦能促進人體中脂質過氧化反應,出現自由基和活性氧等產物,進一步誘發細胞發生毒性作用,使肝細胞受到損傷,這也是患兒出現肝功能異常的原因之一[15]。ALT 和AST 是臨床中公認的檢測肝功能損害時的敏感指標，也可以在一定程度上反映肝功能受損的輕重水平。

在本研究中,EBV—DNA陰性組肝腎功能異常患者的構成比例低于低載量組、中載量組和高載量組(P<0.05)；低載量組中肝腎功能異常患者的比例低于中載量組、高載量組(P<0.05)；中載量組中肝腎功能異常患者的比例低于高載量組，差異有統計學意義(P<0.05)。說明了EB病毒感染的患兒確實會有肝功能異常的現象,并與陶小娟等[18-20]研究結果相同。

EB病毒感染所引起的腎臟損傷迄今為止并無確切的流行病學調查，我國有研究指出，EB病毒感染相關性腎損傷的死亡率可達1.7%～15.7%，其中兒童期所出現的急性腎損傷較大可能與EB病毒感染相關[19]。血清CysC為內源性小分子蛋白質，循環血液內CysC幾乎完全經腎小球濾過而被清除，大部分被腎小管重吸收和降解，一次可有效反映腎功能損傷和腎小球濾過率變化情況。且血清CysC在細胞內產生速度恒定，各種液體中均存在，檢測取樣方便快捷。不容易受到其他因素的影響。血清CysC對EB病毒感染兒童腎損傷的有較佳的診斷效果[20]。本研究分別對各組患兒CysC、β2-MG進行檢測且與EBV-DNA 的拷貝數進行相關性分析發現，EBV-DNA陽性組患兒腎功能異常比率明顯高于陰性組，且DNA高載量組CysC、β2-MG明顯高于中載量組、低載量組及陰性組，中載量組高于低載量組及陰性組，低載量組高于陰性組，且差異均有統計學意義,CysC、β2-MG與 EBV-DNA的拷貝數有很高的正相關性，EBV-DNA中、高載量組ALT、AST、CysC、β2-MG均明顯升高，提示患兒存在腎功能損傷。

由此可以認為，EBV-DNA等在一定程度上可以反應肝、腎功能的受損程度。有相關文獻報道，EBV-DNA病毒還與人體受累器官損害程度及疾病的種類、嚴重度和病死率呈正相關[21]。因此，EBV-DNA病毒檢測可用于評估病情及療效。