EDC-NHS交聯的骨骼肌脫細胞支架對心肌細胞生物功能性的影響

劉淑茵 方展鴻 鄒小明

南方醫科大學第五附屬醫院（廣州510000）

心血管疾病（CVD）已成為全世界病死率和發生率第二高的疾病［1-2］，其中心肌梗死是導致心功能不全和心力衰竭的重要原因之一［3］。心肌梗死主要表現為心肌細胞壞死、瘢痕組織形成和心臟收縮受限［4］。傳統的心梗治療方法雖有一定的修復效果，但是由于心肌細胞的再生能力有限、藥物和手術費用較高等限制了其廣泛運用。目前利用組織工程技術構建的工程化心肌補片被認為是修復梗死心肌組織的一種有效策略［5-6］。

工程化心肌補片是由支架和/或治療細胞組成，能夠構建心肌再生微環境從而促進心肌梗死組織修復和再生。其中脫細胞支架的天然細胞外基質不僅能為細胞提供一個仿生的三維支持載體，還能促進宿主細胞的遷移、增殖、分化等，從而促進梗死區組織再生和修復［7］。一些研究者曾用豬心臟組織進行脫細胞制成心肌補片并能有效修復心梗組織［8-9］。但心肌組織占比較少，來源有限，在大規模制備和應用中受限。因此，研究者們考慮開發其他組織的脫細胞支架來作為工程化心肌補片的支架材料來源。

目前骨骼肌脫細胞支架主要應用于神經修復、肌肉再生和脂肪再生等領域［10-12］，大部分骨骼肌脫細胞支架以混合水凝膠制作特定功能工程化補片為主［13］。天然的骨骼肌脫細胞支架主要成分為膠原，膠原間連接松散且排列雜亂，力學強度低［14］。而工程化心肌補片需要仿生的力學強度來抑制心肌梗死后的心臟擴張。本研究擬利用大鼠腹直肌組織進行脫細胞處理形成骨骼肌脫細胞基質（rectus abdominis decellularized matrix，RADCM），交聯修飾后形成機械性能較好的脫細胞支架（rectus abdominis decellularized matrix/EDC，RADCM/EDC）。對骨骼肌中的腹直肌脫細胞支架進行化學交聯處理來提高其力學強度并制備工程化心肌補片，心肌細胞種植在交聯后的脫細胞支架上以制備工程化心肌補片。通過腹直肌脫細胞支架與心肌細胞共培養，研究其促心肌細胞成熟的作用；并通過腹直肌脫細胞支架與人臍靜脈血管內皮細胞共培養，研究其對血管生成的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑 實驗動物來源于南方醫科大學動物實驗中心，蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（雷根，中國）、Masso 三色染色試劑盒（Solarbio/索萊寶，中國）、DAPI 染色液（雷根，中國）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC（麥克林，中國）、N-羥基琥珀酰亞胺（HOSu）-NHS（麥克林，中國）、Live＆Dead Viability試劑盒（Everbright，美國）、F-actin（abcam，英國）、兔抗CX-43（Affinity，中國）、鼠抗α-actinin（Abcam，英國）、488 donkey anti-mouse（invitrogen，美國）、568 donkey anti-rabbit（invitrogen，美國）、cDNA 合成試劑盒（GeneCopoeia，美國）、2x All-in-One qPCR 試劑盒（GeneCopoeia，美國）。

1.2 方法

1.2.1 制備脫細胞支架 取SD 大鼠腹直肌肌肉組織，反復凍融三次后浸入到烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12 h；再加入含DNA 酶和RNA 酶的0.05 mol/L MgCl2溶液中，在37 ℃下振蕩24 h 得到。對樣品采取HE 染色、MASSON 染色以及DAPI 染色，并在顯微鏡下觀察。

1.2.2 腹直肌脫細胞支架化學交聯 將腹直肌脫細胞支架分別浸入0.5/1/2 mol/L 的EDC 溶液中，將NHS 按nEDC∶nNHS 為4∶1（w/w）的量加入，以嗎啉乙磺酸為緩沖劑調節pH 值至5.5，4 ℃下放置24 h，再用0.1 mol/L 的Na2HPO4溶液浸泡1 h 得到。腹直肌脫細胞后不同EDC-NHS 濃度交聯后分為4 組，分別為腹直肌單純脫細胞組（RADCM）、腹直肌脫細胞后與0.5 mol/L EDC 交聯組（RADCM/EDC 0.5）、腹直肌脫細胞后與1 mol/L EDC 交聯組（RADCM/EDC 1）、腹直肌脫細胞后與2 mol/L EDC交聯組（RADCM/EDC 2）。

1.2.3 形貌觀察 將4 組脫細胞支架凍干后用導電膠黏附于銅臺上，噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察膠的情況。

1.2.4 力學測試 將4 組脫細胞支架用材料試驗機（Instron 5980）進行拉伸力學測試。

1.2.5 生物相容性研究 支架上種植H9C2 細胞（1.5 × 104/cm2），用Live＆Dead Viability 試劑盒進行避光染色觀察；用F-actin 和DAPI 進行染色觀察；并用Image J 軟件進行數據分析。

1.2.6 免疫組化染色進行脫細胞支架功能分析 種植原代心肌細胞（1.5×104/cm2）。第7天進行免疫組化染色，一抗CX-43（1∶250）和α-actinin（1∶250）4 ℃孵育過夜，488 donkey anti-mouse（1∶200）和568 donkey anti-rabbit（1∶200）二抗中避光孵育2 h，DAPI 染色。在支架上種植HUVECs（1.5×104/cm2），用F-actin 和DAPI染色液進行染色，在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 qRT-PCR 檢測血管特異性基因 從細胞中提取總RNA，用qPCR cDNA合成試劑盒逆轉錄合成第一鏈cDNA，用2x All-in-One qPCR 試劑盒按標準進行擴增；用2-ΔΔCT方法對數據進行分析和比較。對照組的倍數變化歸一化為GAPDH mRNA的表達。

1.3 統計學方法 數據采用軟件SPSS 20.0 進行分析，計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊則采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，若方差不齊則采用Dunnett′s T3 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 利用不同染色方法觀察腹直肌組織脫細胞效果 由HE 染色、MASSON 染色和DAPI 染色可見，脫細胞前可見明顯細胞核和細胞質結構（圖1A）；脫細胞后基本未見細胞核，可見松散的膠原纖維（圖1B），說明所用脫細胞方法有效。

2.2 4 組腹直肌脫細胞支架的掃描電鏡和Elisa 檢測VEGF 含量 脫細胞后腹直肌各組支架無明顯區別（圖2A）；掃描電鏡可見RADCM 組膠原結構排列整齊但松散；交聯后腹直肌脫細胞支架膠原方向由縱向轉為網狀，RADCM/EDC 0.5 組網孔直徑約（15±5）μm，網孔較規則，其余交聯組網孔較大且不規則（圖2B）。ELISA 檢測可見各組材料上均存在VEGF，RADCM/EDC 0.5 組在交聯劑組中VEGF 的含量最高（圖2C）。

圖2 4 組腹直肌組織脫細胞支架掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of 4 groups decellularized scaffold of rectus abdominis tissue

2.3 腹直肌組織脫細胞支架力學表征 脫細胞支架的應力應變曲線和彈性模量隨著交聯劑的濃度上升，各組彈性模量均在工程化心肌補片范圍內（P＜0.01）。見圖3。

圖3 4 組腹直肌組織脫細胞支架力學表征Fig.3 Mechanical property characterization of decellular scaffold of rectus abdominis tissue

2.4 腹直肌脫細胞支架的細胞相容性 H9C2細胞在支架上活死染色3 次檢測各組活細胞率均大于80%，表明各組均具有良好的生物相容性（圖4A）。第3 天4 組活細胞面積占比約在（45 ± 15）%；第7 天RADCM 和RADCM/EDC 0.5 組 大于80%，而RADCM/EDC 2 組只見零星細胞。RADCM/EDC 0.5組活細胞面積占比最高，交聯劑濃度越高細胞面積占比明顯減少，說明0.5 mol/L EDC/NHS 交聯產生的支架最適合用于進一步構建工程化心肌補片（P＜0.01，圖4B）。

圖4 單純腹直肌組織脫細胞支架與不同濃度EDC-NHS 交聯后腹直肌組織脫細胞支架的生物相容性Fig.4 Biocompatibility of decellular scaffold of rectus abdominis tissue without and with EDC-NHS crosslinking treated

2.5 心肌細胞在不同脫細胞支架材料上的形態和心肌特異性蛋白表達情況 通過F-actin 和DAPI 染色，觀察其細胞伸展情況（圖5A）。在第7天F-actin表達面積占比：RADCM/EDC 0.5 組最大，可見明顯細胞伸展且細胞狀態良好。RADCM/EDC 2 組約（7.7±2）%，細胞明顯不伸展。觀察心肌細胞肌節生長情況（圖5B），可見0.5 mol/L EDC/NHS 交聯組肌節形成和CX-43 表達最高（P＜0.001，圖5）。

圖5 腹直肌組織不同脫細胞支架上心肌細胞的形態和心肌特異性蛋白表達情況Fig.5 The morphological and cardiac-specific proteins of cardiomyocytes in different decellularizad scaffold of rectus abdominis tissue

2.6 HUVECs 在不同脫細胞支架材料上的血管生成情況 爬片上可見密集分布的HUVECs，但未見血管樣管腔形成。未交聯組和0.5 mol/L 交聯組均可見血管樣管腔形成，且0.5 mol/L 組形成的血管樣管腔更多且管腔內徑更大（P＜0.01，圖6）。qRT-PCR檢測血管形成相關的VEGF 和eNOS 的基因表達（圖6C），結果顯示：RADCM/EDC 0.5組VEGF和eNOS的基因表達量最高，這和前面的結果是一致的。

圖6 腹直肌組織不同脫細胞支架上HUVECs 骨架、血管形成相關基因和VEGF 表達情況Fig.6 The morphological、angiogenesis related genes and VEGF of HUVECs in different decellularized scaffold of rectus abdominis tissue

3 討論

工程化心臟補片（ECP）是一種新興的心肌梗死（MI）治療方法，而脫細胞材料的引入是構建低免疫性補片的有效方法［15-16］。本文采用的溫和脫細胞方法，盡可能地保留其膠原的排列和連接，同時降低其免疫原性。骨骼肌細胞外基質不僅擁有與心肌細胞外基質相似的生物活性成分，而且骨骼肌組織也具有良好的收縮性，其細胞外基質Ⅰ、Ⅳ膠原及各種生長因子等含量豐富。此外，骨骼肌來源廣泛，因此選取骨骼肌脫細胞支架制備工程化心肌補片。

脫細胞后組織的膠原間連接松散且排列雜亂、易發生收縮形變以及力學強度低機械性能不足等缺點［17］。而工程化心肌補片需要仿生的力學強度來抑制心肌梗死后的心臟擴張，因此本研究對脫細胞支架進行化學交聯。EDC 溶液是個可溶于水的碳二亞胺，幫助膠原分子間的羧基和氨基之間反應形成酰胺鍵，而試劑EDC 和NHS 本身并沒有成為實際交聯的一部分，可以消除并被清洗掉。通過與EDC、NHS 溶液交聯，掃描電鏡可見膠原從縱向結構變成了交錯的網絡結構，其與天然心肌組織的肌肉方向相似，并且其有效提高了材料的力學強度，0.5 mol/L EDC/NHS 交聯組的力學強度更接近人體天然心室肌力學強度［18］。天然的細胞外基質中細胞因子含量豐富，在調節細胞行為和血管肌肉再生方面起著關鍵作用。已知血管內皮生長因子（VEGF）在心臟修復時可促進血管生成并改善心梗后心臟功能［19-20］，而本研究制備的各組骨骼肌脫細胞材料上ELISA 檢測均有骨骼肌組織原有的VEGF，這可能對后續促進血管化有利，而其他脫細胞工程化心肌補片基本無天然細胞因子殘留。

此外，由于EDC和NHS的交聯形成的膠原網絡細胞存活率高，細胞存活面積占比RADCM/EDC 0.5組最高，其更加適合細胞的生長，并用于進一步構建工程化心肌補片。在共聚焦顯微鏡下觀察，RADCM 組很多死細胞卡在膠原間隙中，可能因為其縱行結構不利于細胞黏附，而RADCM/EDC 2 組細胞到7 d 時細胞數量明顯減少，可能是由于過高濃度的交聯劑雖然可以有效提高力學強度，但過高濃度交聯使得支架表面孔隙減少，細胞不利于黏附生長，這也進一步證明通過低濃度交聯增加膠原間連接是有利的。

在原代心肌細胞培養中，RADCM/EDC 0.5 組種植的CMS之間形成了明顯的肌節和CX-43，表明0.5 mol/L 交聯可以促進心肌細胞的成熟和功能化，這可能是因為0.5 mol/L 交聯組的力學強度和結構更接近天然心室肌。種植的HUVECs 經F-actin 染色，未交聯組和0.5 mol/L 交聯組均可見血管樣管腔形成。血管形成通過qRT-PCR 驗證，RADCM/EDC 0.5 組支架的VEGF 和eNOS 含量最高，其對血管的生成具有促進作用。因此，骨骼肌脫細胞支架制備的工程化心肌補片可以為細胞提供合適的三維微環境，促進外源性CMS 和HUVECs 的成熟和功能化。由此推測RADCM/EDC 0.5 工程化心肌補片可能對心梗修復血管化有一定促進作用，因此具有心梗后心臟修復的潛能。