乳果糖對失血性休克大鼠急性肺損傷的作用及機制

鄭強 唐勇 周程繼 谷子 劉世平

1成都市第二人民醫院急診科（成都617000）；2川北醫學院附屬醫院急診科（四川南充637000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是創傷失血性休克（hemorrhagic traumatic shock，HTS）晚期死亡的主要原因，而創傷失血性休克早期即可出現ALI［1］。氫氣是自然界含量豐富、易得、廉價、儲存簡單及方便的一種分子量極小的氣體，它可以自由并快速地在組織間穿梭，從而加快氫分子與細胞內分子的生化反應［2］。最新國內外研究［3-6］發現，氫氣對腦、腸、腎、脊髓等器官通過抗氧化、清除氧自由基等方式，對于缺氧缺血及再灌注損傷具有良好的保護作用。乳果糖是一種人工合成的雙糖，可被定植在胃腸道的菌群分解，產生大量的氫氣，氫氣快速進入組織，通過抗氧化等方式發揮組織保護作用［7］，但具體機制尚不清楚。因此本研究推測在失血性休克動物模型中，乳果糖可通過動物模型胃腸道的菌群分解產生氫氣，氫氣快速進入組織發揮抗氧化等作用，抑制炎癥因子的釋放，進而對急性肺損傷發揮保護作用。故本研究擬采用乳果糖灌胃干預失血性休克大鼠模型，探討乳果糖對模型急性肺損傷的保護作用及其機制，從而為臨床干預創傷失血性休克提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 雄性SD 大鼠由成都達碩實驗動物有限公司提供。

1.1.2 試劑與設備 IL-6、IL-1β 試劑盒由武漢六合生物技術有限公司提供；SOD、MDA、MPO 試劑盒由南京建成科技有限公司提供；抗兔HMGB1 單抗購自美國Santa 公司；抗羊二抗購自上海基因科技有限公司。以上標本的檢測及實驗設備均按照操作說明書進行并嚴格遵守成都天府生命科技園各實驗室標準操作規程。

1.1.3 倫理審核 川北醫學院附屬醫院及成都市第二人民醫院科研委員會批準了所有的研究方案。

1.2 方法

1.2.1 建模 選用250 ～300 g 的雄性SD 大鼠，使用1%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔內注射麻醉，固定，碘伏消毒，外科手術分離左右股動、靜脈并置管，股動脈連接三通管后接壓力轉換器（Pclab-530C生物醫學信號采集系統）、計算機行持續血流動力學監測和抽血，股靜脈用于輸液。經股靜脈緩慢抽血放血30 min，使平均動脈壓（MAP）逐漸降至35 mmHg，并維持60 min，在90 min 時給予生理鹽水復蘇，使MAP 控制在（50±2）mmHg，維持60 min。150 min后，以血液回輸及生理鹽水復蘇，使MAP 控制在≥80 mmHg，并維持120 min。270 min（復蘇成功）后處死，采集血液及肺組織。

1.2.2 分組 失血性休克模型制備前60 min，先分為乳果糖預灌胃組即實驗組2（10 只）：在模型制備前60 min給予乳果糖0.25 g/kg（稀釋到0.75 mL/kg）灌胃。將實驗組2 及未進行乳果糖預灌胃處理的SD 大鼠同時麻醉，左右股動靜脈置管成功后再將未進行乳果糖預灌胃處理的SD 大鼠分為三組：假手術組即空白組（10 只）：僅作置管；生理鹽水復蘇組即對照組（10 只）：在MAP 降至35 mmHg時等體積生理鹽水灌胃；乳果糖治療組即實驗組1（10 只）：在MAP 降至35 mmHg 時給予乳果糖0.25 g/kg（稀釋到0.75 mL/kg）灌胃。四組實驗動物置管成功后制備失血性休克模型。

1.2.3 標本收集及處理 （1）在實驗期間，持續監測生命體征（Pclab-530C 生物醫學信號采集系統）。（2）在0、30 及270 min 分別測定血氣和乳酸值（ABL90 血氣分析儀）。（3）Western blot 法檢測270 min 肺組織高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）行聚丙烯酰胺凝膠電泳：將目標蛋白移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，PBS 洗膜后，一抗（抗兔HMGB1 單抗）4 ℃過夜，洗膜后加入二抗（抗羊二抗），37 ℃孵育1 h，用化學發光劑避光反應，將硝酸纖維素膜放至暗室中曝光顯影。以β-actin為內參照，目標蛋白與其相比進行半定量分析；Elisa 法檢測270 min 血IL-6、IL-1β。（4）270 min 取肺組織一部分用10%甲醛溶液固定24 h，逐級乙醇脫水、二甲苯浸泡、浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼、HE 染色后由我院病理科2 位有經驗的病理學醫生采用雙盲法對每個標本進行分析。（5）270 min 取5g 肺組織碾磨并生理鹽水定量稀釋后用比色法檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、TBA法檢測髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）。

1.3 統計學方法 計量資料的數據用均數±標準差表示，均數間差異比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。所有統計均采用SPSS 25.0 軟件包進行分析。

2 結果

2.1 基本實驗資料 0 min MAP:（130.0±15.7）mmHg，30 min MAP：（35.0 ± 1.3）mmHg，90 min MAP：（50±1.8）mmHg，270 min MAP：（112±13.8）mmHg。符合實驗失血性休克各階段建模要求。見圖1。

圖1 失血性休克模型MAP 和心率電腦采集圖（Pclab-530C 生物醫學信號采集系統）Fig.1 MAP and heart rate computer acquisition map of hemorrhagic shock model（Pclab-530c biomedical signal acquisition system）

2.2 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 動物模型血氣及乳酸值分析 在270 min 時，對照組PO2值明顯低于空白組、實驗組1及實驗組2（P＜0.05）。其余動脈血氣分析及乳酸值各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 血氣及乳酸值Tab.1 Blood gas and lactic acid values of blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 ±s

表1 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 血氣及乳酸值Tab.1 Blood gas and lactic acid values of blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 ±s

注：在225 min 時，對照組 分別與空白組、實驗組1 及實驗組2 比較Po2，*P ＜0.05

pH Po2（mmHg）Pco2（mmHg）HCO3-（mmol/L）堿剩余（mmol/L）乳酸（mmol/L）時間（min）0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270空白組7.39±0.02 7.27±0.04 7.30±0.02 98.7±2.4 83.6±3.1 95.5±4.7 41.5±1.6 31.7±0.7 38.7±3.1 23.5±1.7 15.2±1.4 18.7±1.2 3.1±0.3-15.8±1.6-5.8±0.6 1.7±0.2 13.2±1.7 7.3±0.5對照組7.41±0.03 7.22±0.03 7.26±0.03 96.8±3.5 78.5±5.8 81.6±6.1 42.7±0.5 30.5±1.3 37.5±2.5 23.4±2.3 13.7±2.5 18.0±1.8 3.1±0.4-18.2±2.2-8.2±1.1 1.6±0.3 15.4±2.1 8.6±1.6實驗組1 7.40±0.03 7.27±0.03 7.31±0.03 98.8±3.0 86.6±4.9 97.2±3.7 42.1±1.4 30.6±1.2 38.6±1.9 22.2±2.0 15.2±2.2 19.1±2.2 3.0±0.4-15.7±1.6-6.9±1.3 1.5±0.2 13.8±1.9 8.0±1.5實驗組2 7.41±0.02 7.28±0.04 7.32±0.03 98.6±2.8 83.1±3.3 96.8±4.2 41.5±1.0 31.8±1.1 38.8±1.5 21.8±2.6 15.1±1.9 19.4±2.5 3.2±0.3-15.5±1.4-7.2±1.1 1.6±0.2 14.0±1.2 8.1±0.9 P 值0.40 0.41 0.28 0.39 0.18 0.04*0.39 0.21 0.29 0.18 0.14 0.09 0.36 0.11 0.18 0.22 0.10 0.09

2.3 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 的IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 與空白組比較，對照組、實驗組1 及實驗組2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 均較高（P＜0.05）；對照組與實驗組2、實驗組1 與實驗組2 分別比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPOTab.2 Blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 IL-6，IL-1β，SOD，MDA，MPO ±s

表2 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPOTab.2 Blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 IL-6，IL-1β，SOD，MDA，MPO ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與對照組比較，#P ＜0.05；與實驗組1 比較，&P ＜0.05

組別空白組對照組實驗組1實驗組2 IL-6（pg/mL）15.3±5.5 74.6±16.5*66.8±14.2*60.6±13.6*#&IL-1β（pg/mL）25.2±18.2 149.5±44.6*145.5±46.3*130.3±48.5*#&SOD（u/g）52.6±15.3 206.5±36.4*224.4±32.8*237.7±33.6*#&MDA（nmol/mg）38.6±11.3 186.5±20.6*181.2±22.8*175.2±24.6*#&MPO（ng/mL）69.2±12.5 279.2±48.6*272.5±40.6*248.5±32.6*#&

2.4 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 的HMGB1 蛋白免疫印跡 對照組HMGB1 分別與空白組、實驗組1 及實驗組2 比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 空白組、對照組、實驗組1 及實驗組2 的HMGB1 蛋白免疫印跡Fig.2 Western blot of HMGB1 protein in blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2

2.5 空白組、對照組及實驗組（1、2）的肺組織病理切片 實驗組1 較實驗組2 肺泡內皮及肺泡組織明顯破壞，炎性細胞浸潤明顯。對照組較實驗組1及實驗組2 肺泡內皮及肺泡組織破壞嚴重，炎性細胞浸潤更加明顯。見圖3。

圖3 空白組、對照組及實驗組1 及實驗組2 肺組織病理切片（HE 染色×200）Fig.3 Pathological sections of lung tissues in blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2（HE×200）

3 討論

嚴重失血是創傷導致死亡的主要原因，約占創傷致死的30% ～40%［8］。在失血性休克發生后肺往往是最先和最易受累的器官，一般發病早期即可出現ALI，ALI 的發生率高達80%以上［9］。創傷失血性休克的處理主要在于早期的液體復蘇，恢復機體有效血容量，滿足組織的灌注阻止器官組織缺血壞死［10］。然而，在液體復蘇時，往往引起組織再灌注損傷。組織產生大量的氧自由基，氧自由基可作為信息分子，廣泛激活炎癥系統，在肺組織中會有大量炎性細胞的聚集，并產生大量的細胞因子、趨化因子、氧自由基及其他一些炎性介質等，可引起肺部炎癥和ALI［11-14］。

HMGB1 是一種保守的非組蛋白核蛋白，廣泛分布于淋巴、腦、肝、肺、心、腎等組織中，胞核HMGB1 可調控核小體穩定、DNA 的重組復制、修復及轉錄。研究［15］表明，HMGB1 參與了失血性休克急性肺損傷的過程，失血性休克可引起組織中HMGB1 濃度升高，HMGB1 可誘導NF-κB、IL-1β等炎癥因子釋放進而誘發ALI，抑制HMGB1 信號可減輕ALI。

氫氣可選擇性的作用于活性氧簇ONOO-和OH-，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，能減輕組織缺血再灌注損傷。研究［16］證明，在鼠膿毒癥模型中，吸入氫氣，可抑制氧化應激，降低血液、肝、腎、肺組織中HMGB1 的濃度。在肝缺血再灌注損傷大鼠模型中，氫氣同樣可減輕氧化應激反應，抑制HMGB1 的釋放，抑制炎癥反應，從而發揮肝保護作用［17-19］。

乳果糖是一種人工合成的雙糖，常被用于便秘和肝性腦病等的治療。乳果糖可被定植在胃腸道的菌群分解，產生大量的氫氣，發揮組織保護作用［20］。在大鼠大腦中動脈栓塞模型中，乳果糖通過胃腸道的菌群分解產生氫氣，氫氣進入腦組織減輕氧化性損傷、細胞凋亡，減少梗死面積［21］。在70%部分肝切除肝再生大鼠模型中，乳果糖通過胃腸道的菌群分解產生氫氣，氫氣進入肝組織可升高SOD 水平，抑制HMGB1，進而降低ALT、AST及丙二醛MDA 的水平，促進肝細胞再生［22］。

IL-6、IL-1β 具有較強的促炎活性，可誘導多種促炎介質，如細胞因子和趨化因子，并最終導致廣泛的炎癥事件。SOD 是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，降低MDA、MPO 及多種炎性介質的水平，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用，與很多疾病的發生、發展密不可分［23］。本研究結果顯示空白組IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 分別與對照組、實驗組1 及實驗組2 比較均有明顯差異，且對照組、實驗組1 及實驗組2 上述指標均大幅度增高；實驗組2 除SOD 結果高于對照組及實驗組1 外，IL-6、IL-1β、MDA、MPO 較對照組及實驗組1 低；然而實驗組1 較對照組上述指標無明顯差異，可能與最后實驗采集標本時間過短有關，未能達到預期值。在肺病理學切片結果可以看出實驗組1較實驗組2肺泡內皮及肺泡組織明顯破壞，炎性細胞浸潤明顯。對照組較實驗組1及實驗組2 肺泡內皮及肺泡組織破壞及炎性細胞浸潤更加明顯。血氣分析結果可以看出在225 min 時，對照組Po2明顯低于空白組、實驗組1 及實驗組2，提示失血性休克模型引發了模型急性肺損傷，而乳果糖減輕了模型的急性肺損傷，增加了氧飽和度。以上結果說明乳果糖預灌胃組對肺組織保護作用要優于失血性休克造模后乳果糖灌胃組，進一步說明乳果糖對失血性休克大鼠的肺組織具有保護作用。

HMGB1 可調控核小體穩定、DNA 的重組復制、修復及轉錄，誘導多種炎性因子的釋放，如IL-6、IL-1β 等，進而造成多種器官的損傷［24］。本研究結果顯示實驗組1 較實驗組2 HMGB1 蛋白水平高。對照組較空白組、實驗組1 及實驗組2 HMGB1蛋白含量最高。從上述結果可以看出失血性休克時可引起體內HMGB1 蛋白含量迅速增高，而實驗組1 及實驗組2 HMGB1 蛋白含量明顯低于對照組，提示乳果糖可降低失血性休克大鼠模型的HMGB1 蛋白含量，進而降低IL-6、IL-1β 等炎性因子，保護肺組織。

綜上所述，在失血性休克模型中，乳果糖可通過胃腸道的菌群分解產生氫氣，氫氣快速進入組織可促進SOD 的生成并抑制HMGB1 的生成，進而抑制IL-6、IL-1β、MDA、MPO 等炎性介質的釋放，保護肺組織，這將為臨床搶救失血性休克患者、預防ALI 提供參考及干預的靶點。