紫草素對MC3T3-E1細胞增殖、分化、礦化及成骨相關基因表達的影響

王莉平 林靜 薄雨佳 趙今

新疆醫科大學第一附屬醫院（附屬口腔醫院）牙體牙髓病科（烏魯木齊830054）

牙周病是一種以牙周軟硬組織破壞為特征的慢性炎癥性疾病，表現為牙齦萎縮、牙槽骨吸收等，嚴重時牙齒甚至松動脫落，危害口腔健康［1-2］。傳統治療方法雖能良好地控制炎癥，阻斷或延緩疾病進程，但對于已經造成牙周缺損的患者治療效果欠佳，因此應用藥物控制牙周炎癥、阻斷牙槽骨吸收和促進牙槽骨再生也是不可或缺的輔助方法［3-4］。研究發現多種具有抗炎作用的天然藥物被證實在維持骨代謝平衡中發揮著積極作用［5］。

新疆道地藥材紫草是我國最主要的商品紫草，紫草素是從紫草中提取出來的萘醌類化合物，是其主要成分［6-7］，藥用價值很高，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌等廣泛的生物活性［8］。FAN 等［9］學者證實紫草素對脂多糖誘導的牙周膜細胞具有抗炎作用，是一種潛在牙周抗炎藥物。也有研究表明［10］紫草素通過在體外抑制破骨細胞生成和在體內改善去卵巢小鼠的骨質流失來預防骨質流失。但紫草素在成骨分化的研究較少且機制有待進一步挖掘。

OPG/RANKL 信號軸是調控骨代謝的重要通路之一［11］，中藥作為新型防治骨代謝疾病的藥物，還有待進一步開拓。體外培養的成骨細胞也是進行骨代謝疾病新藥篩選和藥效學評價的重要模型。為此，本研究以成骨細胞作為干預對象，基于OPG/RANKL 信號軸研究不同濃度紫草素對成骨細胞成骨分化的影響及成骨過程中可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1 細胞株，購自武漢Procell，貨號：CL-0378。

1.1.2 藥物 紫草素購自中國上海源葉，貨號：B21682，純度≥98%，20 mg/瓶。

1.1.3 主要實驗儀器 超凈工作臺（蘇凈安泰，中國）；細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；移液槍、冷凍離心機（Eppendorf，德國）；倒置顯微鏡（ZEISS，德國）；全自動酶標儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；實時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 7500 Fast，美國）。

1.1.4 主要試劑 α-MEM 培養基、trypsin-0.25%EDTA 胰蛋白酶（Gibco，美國）；胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液（BI，印度）；MC3T3-E1 細胞誘導分化培養基、茜素紅染液（Cyagen，美國）；細胞增殖毒性檢測試劑盒CCK-8（Dojindo，日本）；堿性磷酸酶染色液（碧云天生物技術有限公司，中國）、堿性磷酸酶測試盒（南京建成生物工程研究所，中國）；Triton-X100（索萊寶生物科技有限公司，中國）；二甲基亞砜（Sigma，美國）；Trizol（invitrogen，美國）；cDNA 合成試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）；引物序列（上海生物工程公司，中國）；QuantiNova? SYBR? Green PCR Kit 試劑盒（QIA-GEN，德國）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將凍存的MC3T3-E1 細胞復蘇，細胞密度達80% ～90% 后再進行傳代培養，細胞離心后，將細胞懸液按1∶3 進行傳代，每隔2 d 換液1 次，選取對數生長期細胞作為實驗對象。

熱氣體脫附溶劑回收法是用達到一定溫度的惰性熱氣體使吸附在吸附劑內的有機物揮發出來從而脫離。熱氣體脫附回收法具有很高的安全性，回收的溶劑含水量低，便于進一步處理，且基本無二次水污染；系統再生、冷卻、干燥、再吸附的周期可大大縮短。

1.2.2 藥物配制 將28.83 mg 紫草素粉末溶于1 mL DMSO 中，混勻后0.25 nm 濾器過濾除菌得到105 μmol/L 的紫草素母液并分裝于EP 管中，-80 ℃冰箱儲存。實驗時稀釋母液分別至2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μmol/L。

1.2.3 CCK-8 檢測紫草素對MC3T3-E1 細胞增殖的影響 將細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板，細胞貼壁后，棄去舊培養基，分別加入含2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0 μmol/L 紫草素的培養基，培養24、48、72 h 后棄去培養基，加入10 μL CCK8溶液，37 ℃避光孵育2 h 后用酶標儀在450 nm處測定吸光度，計算細胞存活率。進而明確對MC3T3-E1 細胞無毒性作用的紫草素安全劑量作為后續實驗組藥物濃度。

1.2.4 實驗分組 對照組：成骨誘導培養基；實驗組：成骨誘導培養基+不同濃度紫草素（0.5、0.25、0.125、0.062 5 μmol/L）

1.2.5 堿性磷酸酶染色 將細胞以2×104個/孔的密度接種于24 孔板，待細胞融合達60%～70%后，更換為含有不同濃度紫草素的成骨誘導培養基，每3 天換一次液，分別誘導7、14 d。誘導完成后棄去培養基，PBS 清洗，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，棄液后PBS清洗3次，每次3 min，加入500 μL現配好的堿性磷酸酶孵育液避光室溫孵育30 min，棄液后PBS 清洗3 次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 堿性磷酸酶活性檢測 將MC3T3-E1 細胞以2 × 105個/孔的密度接種于六孔板中，培養7、14 d 后終止培養（培養方法同上），棄液后加入預冷的PBS 清洗3 遍，每孔加入300 μL 0.1%TritonX-100裂解液，4 ℃孵育30 min后，細胞刮刮下裂解細胞，將裂解液轉入EP管中，4 ℃，1 200 r/min，離心15 min，收集上清液作為待測樣本。BCA 法測得待測樣本蛋白濃度；按照堿性磷酸酶試劑盒說明書于96 孔板中操作：設置空白孔、標準孔、待測孔，依次加入標準液、緩沖液、基質液，充分混勻，37 ℃水浴15 min 后加入顯色劑終止反應，用酶標儀在520 nm 波長處測定各孔吸光度OD值。計算金氏單位（U/mg）用以反映ALP 活性。細胞中ALP 活力=測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值×標準品濃度（0.1 mg/mL）÷待測樣本蛋白濃度。

1.2.7 RT-PCR 檢測基因表達 MC3T3-E1 細胞在含藥的成骨誘導液中培養14 d，每組設3個平行孔。利用Trizol 法提取總RNA，定量后進行反轉錄。RT-PCR 反應條件：（1）預變性95 ℃2 min；（2）變性95 ℃5 s；（3）退火58 ℃30 s，共40個循環；（4）延伸72 ℃，5 min。檢測OPG、RANKL、RUNT 相關轉錄因子-2（Runt-related transcription factor-2，RUNX2）、Ⅰ型膠原（Type I collagen，COL-I）mRNA 的表達，以β-actin 為內參，引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab.1 Sequence of primers for real-time PCR

1.2.8 茜素紅染色 2×105個/孔的密度接種于六孔板中，待細胞融合達60% ～70%，棄去培養基，加入含紫草素或不含紫草素的新鮮成骨誘導培養基，每3 d 換1 次液，21 d 后終止培養。PBS 清洗六孔板3 次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，棄去固定液，蒸餾水洗六孔板3 次，將水吸干后每孔加1 mL 茜素紅染液室溫下染色30 min，染色完成后吸去染液，蒸餾水洗板子數次，直到染液不再脫落，洗液較為澄清為止。室溫下開蓋晾干，顯微鏡下觀察礦化結節并拍照記錄。

1.3 統計學方法 用SPSS 24.0統計軟件處理實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采取Dunnett-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對MC3T3-E1細胞增殖的影響 CCK8法測得濃度在0.062 5 ～0.5 μmol/L 范圍內紫草素和＜0.1%的DMSO 對MC3T3-E1 細胞毒性較小，結果顯示相對于對照組（未加入紫草素），紫草素加藥后72 h 對MC3T3-E1 細胞的增殖作用隨著濃度的升高而顯著增強（P＜0.05）。見圖1。后續實驗均采取0.5、0.25、0.125、0.062 5 μmol/L 為安全劑量。

圖1 紫草素對MC3T3-E1 細胞增殖的影響Fig.1 Effects of Shikonin on proliferation of MC3T3-E1 cells

2.2 紫草素對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響 通過ALP 染色定性觀察，加入了紫草素的實驗組7、14 d均可見ALP較對照組明顯表達。ALP活性定量也進一步驗證了紫草素可提高ALP活性，促進成骨分化。與對照組相比，各實驗組的ALP活性均有顯著提高，且濃度越大，ALP 活性越高（P＜0.01）。7 d和14 d均促進了ALP的表達，但14 d較7 d相比，ALP 表達呈下降趨勢，且差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2-3。

圖2 堿性磷酸酶活性定量檢測結果Fig.2 The results of alkaline phosphatase activity

圖3 堿性磷酸酶染色顯微鏡下觀察結果（×100）Fig.3 ALP staining（×100）

2.3 紫草素對OPG、RANKL、RUNX2、COL-I表達的影響 RT-PCR 結果顯示，OPG、RUNX2、COL-I mRNA 在加入不同濃度紫草素干預后表達水平較對照組顯著增強（P＜0.01），且這種促進效果呈濃度依賴性。而RANKL mRNA 的表達隨著紫草素濃度的增高逐漸降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 RT-PCR 檢測OPG、RANKL、RUNX2、COL-I mRNA 表達水平Fig.4 The expression levels of OPG，RANKL，RUNX2 and COL-I mRNA were detected by RT-PCR

2.4 紫草素對MC3T3-E1 細胞礦化的影響 茜素紅染色結果顯示，實驗組與對照組相比，各組均形成鈣化結節，實驗組形成的鈣化結節面積大于對照組，紫草素濃度越大，結節越明顯。見圖5。說明紫草素能促進成骨細胞鈣結節的形成從而促進成骨分化。

圖5 茜素紅染色顯微鏡下觀察結果（×100）Fig.5 Alizarin red staining（×100）

3 討論

牙周病從本質上講是由細菌引起的炎癥和免疫反應造成骨穩態破壞的結果，破骨活性增強和成骨細胞成骨活性抑制等可能是牙槽骨炎性骨吸收的主要機制，亦是影響牙周再生的重要因素［12］。現有的牙周治療手段僅僅是控制炎癥不再擴散，對嚴重的牙周炎作用有限，故而新型的促進骨再生的藥物研究對牙周炎的治療具有重大意義。當前紫草素對骨代謝的研究多數仍集中在抑制破骨細胞活性［13］上，對促進成骨細胞活性和增強其功能上研究較少，因而本實驗以成骨細胞作為干預對象，研究不同濃度紫草素對成骨細胞增殖以及分化成熟的影響。

成骨細胞是骨發生和骨重建的物質基礎。一定數量的成骨細胞增殖，才能產生豐富的骨膠原和分泌鈣離子，并通過鈣化形成骨細胞，以維持骨組織生理代謝［14］。評價成骨細胞藥效的常用指標是測定成骨細胞的增殖率和ALP 活性［15］。CCK-8和ALP 活性測定結果表明，紫草素可在一定濃度范圍內對成骨表現出促增殖和分化的作用，且與濃度劑量和時間呈一定的依賴性。這一結果與既往文獻及以往研究結果一致［16］。茜素紅染色是檢驗成骨晚期標志物鈣化結節的經典實驗，以評估成骨礦化能力［17］。茜素紅染色結果顯示，紫草素干預后，成骨細胞鈣化能力確有增加。本研究結果提示紫草素能促進MC3T3-E1 細胞增殖、成骨分化及礦化能力。

OPG 與RANKL 的相對比值被認為是調節骨穩態的關鍵因素［18］，這一比例受到各種促骨激素、細胞因子和藥物的調節［19］。有研究［20-21］報道通過提高OPG/RANKL 比值可抑制破骨細胞的發生來促進成骨細胞的活性及成骨分化。本研究結果表明紫草素干預后，提高了OPG mRNA 水平，降低RANKL mRNA 表達水平。除此之外，RUNX2 和COL-1 表達也相應提高。RUNX2 是一種重要的成骨轉錄因子［22］，有證據表明RUNX2 基因敲除可阻止小鼠成骨細胞的發育［23-24］。COL-I 是一種胞外基質蛋白，刺激成骨細胞粘附和分化，有利于骨的維護和修復［25］。結合RT-PCR 結果推測紫草素在促進成骨細胞的增殖時通過增加成骨細胞OPG 表達來與RANKL 競爭性結合RANK 受體，從而抑制破骨細胞分化，促進成骨分化，但該機制有待于后期的實驗進行深入研究。

綜上所述，紫草素可在體外促進MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化，而這一作用可能與OPG/RANKL有關。該研究是在正常環境中探討紫草素對MC3T3-E1 細胞成骨代謝的影響，今后將進一步模擬炎癥環境下紫草素對MC3T3-E1 細胞成骨代謝的影響并深入探討OPG/RANKL 信號通路在其中的作用。