Rheinheimera sp.QH胞外角蛋白酶KerQH2的生物信息學分析

栗學清，龐 鑫，高慧芳，張廉蕓，宋英達，武翠玲,

（1.長治醫學院基礎醫學部生物化學與分子生物學教研室，山西 長治 046000；2.長治醫學院精神衛生系，山西 長治 046000；3.長治醫學院臨床醫學系，山西 長治 046000）

角蛋白（keratin）廣泛存在于生物體的組織結構中，包括軟角蛋白和硬角蛋白兩大類[1?3]。其中，纖維化的硬角蛋白在自然界中有多種存在形式，包括動物的毛發、羽毛、指甲、蹄、殼、爪、角和鱗片等。由于角蛋白富含二硫鍵并且高度交聯，使其結構非常穩定，不易被普通蛋白酶水解[4?7]。近年來，隨著養殖業的迅速發展，在畜禽產品加工過程中產生大量的毛發和羽毛等角蛋白廢棄物，如不加以有效利用，既浪費資源又污染環境[8]。用傳統的物理化學法降解角蛋白不僅存在工藝繁瑣、條件劇烈、污染嚴重等問題，且氨基酸破壞嚴重，產物不均一，利用率低[9?11]。因此，探究高效、環保的角蛋白降解方法具有重要的應用價值。

角蛋白酶是一種特殊的蛋白酶類，能特異性降解角蛋白，在飼料和食品工業、醫療業、美容業、環境治理等方面具有廣闊的應用前景[12?13]。如角蛋白酶可以降解羽毛等角蛋白，將其轉化為動物蛋白質飼料；羽毛角蛋白中還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸，可以用來制作新型食品添加劑應用到食品加工業中；角蛋白酶可用于肉制品嫩化、燕窩脫毛以及蠶絲脫膠；角蛋白酶可改善藥物在皮膚角質層中的通透性，提高皮膚外用藥物的療效；另外，角蛋白酶還可以用于頭發護理品，脫毛膏的制作等[14?15]。目前市售角蛋白酶主要來源于陸地微生物，如Bacillussp.，Xanthomonas maltophilia和Stenotrophomonassp.[16?18]等。有關海洋菌來源的角蛋白酶報道較少，且缺乏系統的研究。海洋菌分泌的蛋白酶具有陸地菌無法比擬的優越性，如對鹽、去污劑及有機溶劑等的耐受性比較好，在皮革生產、污水處理等鹽離子濃度和有機溶劑濃度較高的工業環境中具有更為實際的應用價值和廣闊的應用前景。此外，海洋菌分泌的蛋白酶在較低的溫度下仍具有較高的酶活性[19?20]，在實際應用中可有效節約成本。因此，探索海洋菌來源的角蛋白酶及其催化機制具有重要的意義。

角蛋白酶KerQH2來源于海洋菌Rheinheimerasp.QH，前期研究發現KerQH2對羽毛角蛋白具有高效降解能力，且對有機試劑和去污劑具有很強的耐受性，具有潛在的工業應用價值。本文利用生物信息學軟件對角蛋白酶KerQH2的氨基酸組成特點、結構特征，對不同不可溶角蛋白底物的酶切位點、與底物分子的相互作用及發揮作用的可能關鍵氨基酸位點進行了預測，以期為深入探究角蛋白酶KerQH2高效降解角蛋白的催化機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Rheinheimerasp.QH分離自渤海潮間帶，將菌株Rheinheimerasp.QH活化后接種于發酵培養基，20 ℃，200 r/min, 培養96 h，8000×g離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液經離子交換層析、SDSPAGE純化后得到角蛋白酶KerQH2，對KerQH2進行質譜鑒定，結果顯示KerQH2為S8家族絲氨酸蛋白酶。

1.2 實驗方法

利用相關生物信息學分析軟件及在線工具對KerQH2氨基酸序列進行分析，表1列出分析項目所應用的在線工具及網址。

表1 生物信息學分析工具Table 1 Bioinformatics analysis tools

2 結果與分析

2.1 角蛋白酶KerQH2的理化性質分析

通過ExPASy: ProtParam（https://web.expasy.org/Protparam/）對角蛋白酶KerQH2的氨基酸組成及理化性質進行分析（表2），發現Gly（11.41%）、Ala（11.98%）、Val（7.79%）與Ser（10.27%）含量相對較高，Cys（1.33%）與Trp（1.52%）含量較低，堿性氨基酸（Arg、Lys、His）含量略高于酸性氨基酸（Asp、Glu），等電點7.18，脂肪指數70.2，蛋白酶不穩定系數小于40，穩定性較好。由ProtScale的K-D預測算法對KerQH2的疏水性進行分析，結果顯示為親水性蛋白質。

表2 角蛋白酶KerQH2的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of keratinase KerQH2

2.2 角蛋白酶KerQH2的二級結構分析

通過PredictProtein（https://www.predictProtein.org/）網站對角蛋白酶KerQH2的二級結構進行預測，結果顯示KerQH2中α-螺旋和β-折疊總的占比較低（分別為14.1%和23.2%），無規則卷曲的含量為62.7%。其中溶劑可及性分析顯示α-螺旋與β-折疊多分布于酶分子的內部，而無規則卷曲多處于酶分子表面。有研究表明，β-折疊和α-螺旋等二級結構形式更有利于維持蛋白質結構的穩定性[21?22]，而無規則卷曲則更易于去折疊而使蛋白質構象發生改變[23]，推測該結構特征有助于KerQH2對結構復雜角蛋白的降解。此外，前期酶學性質研究發現角蛋白酶KerQH2相較于已報道的角蛋白酶在催化性能方面具有的一些優越性，如對有機溶劑DMSO、氯仿、乙醇的耐受性極好，SDS對酶具有一定的促進作用等，這些特性可能與其結構特征有一定的相關性。

2.3 角蛋白酶KerQH2的底物裂解位點預測

從UniProt數據庫中選取角蛋白序列P02451（Larus novaehollandiae）、P02450（Gallus gallus）、Q9BYR7（Homo sapiens）、Q24JX8（Bos taurus）、P02445（Ovis aries）和P02447（Capra hircus），利用蛋白酶特異性預測服務器Prosper （https://Prosper.erc.monash.edu.au/home.html），對角蛋白酶KerQH2的底物裂解位點進行預測[24]。不同類型蛋白酶具有不同的酶切位點，蛋白酶主要包括天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等類型，角蛋白酶KerQH2為S8家族絲氨酸蛋白酶，圖1和表3顯示了角蛋白酶KerQH2對不同來源角蛋白的裂解位點。角蛋白酶KerQH2主要切割疏水性氨基酸Val（V）/ILe（I）和極性氨基酸Cys（C）/Gln（Q）之間形成的肽鍵。KerQH2在底物角蛋白Q9BYR7、P02445和Q24JX8上的酶切位點更豐富，因此推測KerQH2對人、牛和綿羊來源角蛋白的降解效率更高。

表3 角蛋白酶KerQH2對角蛋白的裂解位點Table 3 Keratinase KerQH2 cleavage sites on the keratin

圖1 角蛋白酶KerQH2在底物角蛋白上的裂解位點Fig.1 The cleavage sites of keratinase KerQH2 on the keratin

2.4 多序列比對分析

對KerQH2以及從NCBI下載的15個Rheinheimera屬和Bacillus屬來源的角蛋白酶催化結構域進行多序列比對，結果如圖2所示，不同來源角蛋白酶由Asp（D8）、His（H41）和Ser（S197）構成的催化三聯體高度保守。其中，Asp（D8）位于基序Xaa-Xaa-Asp-Xbb-Gly中（Xaa為非極性氨基酸，Xbb為極性氨基酸），His（H41）位于基序His-Gly-Thr-Xcc-Xaa-Ala-Gly中（Xcc為His/Ala），Ser（S197）位于基序Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xbb-Xaa中。一些極性氨基酸和芳香族氨基酸也高度保守，如：Asp（17、37）、Thr（43、184、196）、Asn（54、135）、Ser（105、166、183）、Pro（144、177）和Tyr（147、190）等。這些氨基酸可能在底物結合中發揮著重要作用[25?26]。而大量保守的Gly和Ala，則由于其分子側鏈較小，因此賦予了角蛋白酶較大的自由度。此外，還存在一些共有序列如：Ser105-Gly109、Ala132-Ala136和Ser142-Ala145等。上述結構特征，可能在KerQH2降解不可溶底物中發揮著重要作用。

圖2 角蛋白酶的多序列比對分析Fig.2 Multiple sequences alignment analysis of keratinase protein sequences

2.5 角蛋白酶KerQH2的同源建模及表面靜電勢分析

利 用 在 線 軟 件 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）蛋白質建模數據庫，以枯草桿菌蛋白酶（PDB：1SCN.1.N，相似度45.98%）為模板進行同源建模，獲得角蛋白酶KerQH2催化結構域的模型。利用蛋白質分析軟件Discovery Studio 2016分析其結構，發現KerQH2催化結構域含有5個α-螺旋、8個β-折疊，其中Asp8、His41和Ser197構成催化三聯體。通過PyMol 2.5.0 軟件對KerQH2進行表面靜電勢分析，結果如圖3所示，角蛋白酶KerQH2中催化三聯體所處空穴多為不帶電荷區域，這與文獻報道的來自Pyrococcus furiosus（PMDB ID: PM0075943）的絲氨酸蛋白酶有所不同，同時研究中還提到蛋白酶的功能多樣性及環境適應性與其表面靜電勢分布有關[27]，因此推測角蛋白酶KerQH2催化三聯體區域的表面靜電勢分布可能與其對不可溶角蛋白底物的特異性吸附、降解有關。

圖3 角蛋白酶KerQH2催化結構域的同源模建Fig.3 Modeled catalytic domain of keratinase KerQH2

2.6 角蛋白酶KerQH2與底物Q9BYR7的分子對接

以枯草桿菌蛋白酶為模板進行同源建模，獲得角蛋白酶KerQH2催化結構域的模型，以PDB:6u9w.1.A為模板進行同源建模，獲得底物Q9BYR7的結構模型。通過Discovery studio分別生成KerQH2及底物Q9BYR7的拉氏圖，以評價模型的合理性。如圖4c中允許區（藍色區域）和最大允許區（紫色區域）內的氨基酸為合理氨基酸，不允許區域（空白區域）的氨基酸為不合理氨基酸。從拉氏圖可以看出，超過90%的氨基酸殘基都落在允許區域和最大允許區域內，KerQH2與Q9BYR7的三維結構模型是可信的，可以用于進一步研究。

圖4 角蛋白酶KerQH2和角蛋白Q9BYR7的建模結果及拉氏圖Fig.4 The modeling results and Ramachandran plots of keratinase KerQH2 and keratin Q9BYR7

將角蛋白酶KerQH2的催化結構域和底物角蛋白Q9BYR7同時置于一個CELL晶格中，在 DOCK PROTEINS 模塊中進行對接，歐拉角度設置為 6°。蛋白對接結果顯示（圖5），KerQH2與Q9BYR7的Zdock Score為12.14，E-Rdock為-24.7547，結合較好。分析對接結果，KerQH2有32個氨基酸殘基在理論上能夠與Q9BYR7的17個氨基酸殘基發生相互作用，維持結合穩定性。KerQH2中互作氨基酸分別為：His41、Phe75、Gly79、Trp81、Thr82、Ser105-Ser111、Gly134-Thr139、Ser142、Tyr143、Val156、Asn157、Leu162-Phe165、Gln167、Val179、Asn180、Ile193、Ser194、Gly195和Ser197。Q9BYR7中互作氨基酸分別為：Lys24、Ser25、Arg27、Cys36、His38-Cys48、Asn50和Cys51。KerQH2與Q9BYR7的氨基酸殘基形成三組分子間氫鍵，其中，Ser164:Asn50和Gly109-Ser110:His38兩組氫鍵單獨存在，位于相互作用面的兩側，使酶催化結構域的構象發生了輕微改變，“凹”字型的凹陷處向外撐開，暴露出酶的催化三聯體（Asp8、His41和Ser197）。而Gly134:Leu42、Asn135:（Leu42、Leu43、Pro45）、Ala136:Ser25、 Asn138:Lys24、 Trp81:Glu44和 Gly107:（Leu42、Leu43）這六個氫鍵構成一組氫鍵，位于相互作用面中心，使酶-底物復合物結構更加穩定。KerQH2與Q9BYR7形成His41:Leu43和Trp81:（Cys36、Val40、Leu43）兩處Pi鍵，維持著酶-底物復合物的穩定性。

圖5 角蛋白酶KerQH2與底物Q9BYR7的分子對接Fig.5 Molecular docking of keratinase KerQH2 with substrate Q9BYR7

此外，結合KerQH2與底物Q9BYR7的分子對接結果進行分析，發現共有序列Ser105-Gly109、Ala132-Ala136和Ser142-Ala145參與了底物的結合，同時，共有序列中富含的Gly和Ala不僅增加了結合位點的疏水性，而且減少了側鏈空間位阻，更有利于角蛋白酶與底物的結合，與文獻中的報道一致[28]。

2.7 系統發育分析

將KerQH2的氨基酸序列以及從NCBI下載的15個Rheinheimera屬和Bacillus屬來源的角蛋白酶氨基酸序列，運用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行分子系統發育分析，采用默認參數，得到分子進化樹（圖6），可以較為精確地確定其進化地位[29?30]。角蛋白酶KerQH2和Rheinheimera屬來源的蛋白WP173499773.1分支聚在一起，具有較近的親緣關系, 且不同種屬來源的角蛋白酶具有一定的保守性。

圖6 角蛋白酶KerQH2的系統發育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of the keratinase KerQH2

3 結論

對海洋菌Rheinheimerasp.QH分泌的角蛋白酶KerQH2的結構特征、角蛋白底物的作用位點及關鍵氨基酸位點的預測結果表明，角蛋白酶KerQH2的特殊結構有助于其降解結構復雜的角蛋白分子，這可能是海洋菌對海洋寡營養環境的一種適應性[31?32]。本研究結果為進一步深入研究KerQH2的降解機制提供了一定的理論依據，為角蛋白酶KerQH2的推廣和應用奠定了一定的理論基礎。后期本團隊將針對這些位點，構建一系列突變體，進一步驗證這些氨基酸對角蛋白酶KerQH2活性的影響。