載姜黃素納米金微球的制備及緩釋性能研究*

馮建海, 徐雪梅, 黎 姿, 覃乙棉, 羅雪玲, 李勝英

納米粒子作為一種新型藥物載體, 具有載體材料易制備、多樣、 載藥量高、 可緩控釋、 能靶向給藥、 生物利用度高等特點, 已受到科研工作者的廣泛關注, 且具有廣闊的發展前景[1-2], 如金納米顆粒(Au NPs)、 銀納米顆粒(Ag NPs)、 C60等。 在上述納米材料中, Au 納米顆粒是一種理想的適用于生物學研究的選擇對象。 金納米粒子擁有高化學穩定性, 易于合成, 粒徑分布窄且精確可控, 具有可調控的光熱性質及良好的生物相容性, 表面易修飾, 表面經過功能化的Au 納米顆粒在細胞誘導、 藥物載體、 臨床診斷及抗體標記等方面尤為有效[3-5]。 如Chen 等[6]利用硫醇化的聚乙二醇和聚丙烯酸對金納米棒進行修飾, 負載阿霉素, 可獲得一種具有較好藥物傳輸的納米材料, 而Li 等[7]用巰基琥珀酸(MSA)和巰基丙酸(MPA)對納米多孔金納米粒子表面進行合理的改性, 發現MSA 修飾的NP-AuNPs 有效地控制了阿霉素的釋放, 這些研究表明改性納米Au 做為藥物載體有減緩藥物的釋放作用。

姜黃素(Curcumin, Cur)是姜科植物姜黃的主要活性成分之一, 據前人研究表明姜黃素具有良好的治療作用, 包括抗腫瘤、 抗菌、 抗氧化、 抗艾滋病病毒和抗炎作用[8-10]。 對于抗癌方面, 在臨床上已有用于乳腺癌, 胰腺癌、 結腸癌等的治療[11-12]。 然而, 姜黃素在水中溶解性差、 穩定性差、 難吸收、 易被機體代謝, 系統快速清除等缺點, 嚴重阻礙其臨床應用[13-15]。納米材料負載藥物構建納米遞藥系統具有較好的生物相容性和靶向性, 有助于藥物的緩慢釋放從而提高藥物的安全性和治療效果, 而成為近年引人矚目的新技術和研究熱點。

本研究采用晶種生長法制備Au 納米微球, 經硅烷偶聯劑表面修飾并進一步裝載姜黃素, 探討Au 納米微球負載Cur 的載藥及緩釋性能, 以期改善姜黃素進入體內的緩釋過程, 提高藥物的生物利用度, 為癌癥的積極診治提供思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4, 分析純), 上海賢鼎生物科技有限公司;姜黃素(分析純), 阿達瑪斯試劑有限公司; 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB, 分析純), 阿達瑪斯試劑有限公司; 硼氫化鉀(CP, 分析純), 國藥集團化學試劑有限公司; 抗壞血酸(分析純), 西隴科學股份有限公司; 無水乙醇(分析純), 西隴科學股份有限公司; N-氫乙基-r-氨丙基甲氧基硅烷(硅烷偶聯劑KH-792, 分析純), 上海麥克林生化科技有限公司; 硅酸四乙酯(TEOS, 分析純), 上海麥克林生化科技有限公司。

Phenom G5 pure 臺式掃描電鏡, 復納科學儀器(上海)有限公司; NICOLET 6700 傅里葉變換紅外光譜儀, 美國賽默飛世爾; Agilent 8453 紫外可見分光光度計, 安捷倫科技有限公司;MINIFLEX 60 X 射線衍射儀, 深圳市萊雷科技發展有限公司;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器, 上海力辰邦西儀器科技有限公司; TGL·18C 高速臺式離心機, 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 Au 種的合成

在圓底燒瓶中加入10 mL 0.10 mol/L 的CTAB 溶液和0.25 mL 0.01 mol/L 的HAuCl4溶液, 磁力攪拌均勻后緩慢加入冰水配制的0.60 mL 0.01 mol/L 的KBH4溶液, 快速攪拌2 min, 溶液于30 ℃放置2 h 后, 即得Au 種溶液。

1.2.2 Au 納米微球的合成

取1.2.1 中所制得的Au 種溶液250 μL, 加入到50 mL 0.10 mol/L 的CTAB 和5 mL 0.01 mol/L 的HAuCl4混合溶液中,在35 ℃水浴快速攪拌下, 加入3 mL 1mol/L 的抗壞血酸溶液,并維持恒溫快速攪拌6 h, 經10000 r/min 離心10 min, 棄去上清液, 沉淀用超純水離心洗滌數次, 沉淀置于60 ℃下干燥,即得Au 納米微球。

1.2.3 硅烷化Au 納米微球

取1.2.2 中所制得的Au 納米微球超聲分散于5 mL 超純水中, 加入10 mL 體積比為7∶3 的乙醇水溶液, 在35 ℃水浴快速攪拌下, 加入0.02 mL TEOS, 反應2 h 后, 加入0.02 mL N-氫乙基-r-氨丙基甲氧基硅烷, 維持恒溫快速攪拌4 h, 反應完成后, 經10000 r/min 離心10 min, 棄去上清液, 沉淀用超純水離心洗滌數次, 沉淀置于60 ℃下干燥, 即得硅烷化Au 納米微球。

1.2.4 Cur-Au 納米微球的制備

取硅烷化的Au 納米微球20 mg 置于250 mL 錐形瓶中, 加入10 mL 1 mg/mL 的姜黃素乙醇溶液, 放于恒溫搖床中, 25 ℃恒溫避光搖晃反應48 h 后, 10000 r/min 離心15 min, 保留上清液, 沉淀經無水乙醇洗滌數次后避光干燥, 即得Cur-Au 納米微球。 稱重, 記為W1。 以未經硅烷化修飾的Au 納米微球作為對照組, 平行試驗3 次。

1.3 測試與表征

(1)將未經過離心的納米Au 溶液用超純水稀釋一定的倍數后, 以未加含Au 元素的反應溶液為空白液, 在紫外-可見光吸收光譜儀波長300 ～1100 nm 進行全波長掃描, 記錄其紫外圖譜。

(2)掃描電鏡觀察Au 和Cur-Au 的表面形貌。

(3)采用X 射線衍射儀, 選擇10° ～90°進行掃描, 得到Au和Cur-Au 的相應圖譜, 對相關材料進行成分分析。

(4)Au 和Cur-Au 的FTIR 分析: 采用溴化鉀壓片, 掃描范圍4000 ～400 cm-1, 比較相關材料結構變化。

(5)采用差熱分析儀測定Au 和Cur-Au 的失重情況, 測定的溫度范圍為20 ～800 ℃, 升溫速率為10 ℃/min。

1.4 包封率和載藥量、 緩釋實驗測定

1.4.1 姜黃素乙醇溶液的標準曲線測定

配制濃度分別為1、 2、 3、 4、 5、 6 mg/L 的姜黃素乙醇標準液, 用紫外分光光度計測定各濃度樣品在427 nm 檢測波長下的吸光度。 吸光度(A)為縱坐標, 以濃度(C, mg/L)為橫坐標, 繪制其標準曲線。

1.4.2 包封率和載藥量的測定

精密吸取適量1.2.4 中經反應離心后所得上清液, 稀釋適當倍數后測定其吸光度, 通過標準曲線計算出相應濃度, 進而推算姜黃素乙醇溶液中未被納米粒子吸附的Cur 含量, 記為W2, 10 mL 1 mg/mL 的姜黃素乙醇溶液所含姜黃素質量為W3;根據下列公式分別計算包封率和載藥量。

1.4.3 Cur-Au 納米微球體外釋藥

取Cur-Au 納米微球20 mg, 用無水乙醇適當稀釋后, 置于預處理好的透析袋中; 另取與Cur-Au 中等質量的純姜黃素,同樣方式處理后, 分別放置于25 mL pH 6.86 的磷酸鹽緩沖液中, 37 ℃下恒溫搖床振蕩。 分別于0.5、 1、 2、 4、 6 h 測定透析液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 材料形貌結構的分析

2.1.1 Au 納米微球的UV-Vis 光譜圖分析

圖1 表示Au 納米微球溶液的紫外-可見光吸收光譜圖, 從圖1 可知, 在波長為545 nm 處有明顯的強吸收峰, 與參考文獻中所制備的Au 納米微球特征吸收波長一致[16-17], 證實Au 納米微球的存在。

圖1 Au 納米顆粒溶液的紫外可見光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra of Au nanoparticles' solution

2.1.2 Au 和Cur-Au 的SEM 分析

圖2 為Au 和Cur-Au 納米微球材料的SEM 圖, 從圖2 可看出, Au 顆粒主要為球形, 粒徑大小較均一, 而負載姜黃素后的Au 納米微球粒徑有變大趨勢, 可能為姜黃素的黏連作用導致。

圖2 Au 和Cur-Au 材料的SEM 圖Fig.2 SEM diagram of Au and Cur-Au materials

2.1.3 Au 和Cur-Au 納米微球的XRD 圖分析圖3 為Au 和Cur-Au 材料的X 射線衍射圖, 由圖3 可知,Au 在2θ 為37.88°、 44.1°、 64.42°、 77.34°, 81.68°出現尖銳的衍射峰, 其中2θ 在37.88°處為最強峰。 通過與Au 的標準XRD 衍射數據對比, 證實采用晶種生長法制備得到了粒徑分布比較窄的Au 納米顆粒, 無其他雜質峰, 說明制備的Au 具有較高的純度和結晶度。 而載姜黃素Au 納米顆粒的XRD 譜圖出峰與Au 納米顆粒的XRD 譜圖一致, 說明姜黃素并沒有改變Au基底物質結構。

圖3 Au 和Cur-Au 材料的XRD 圖Fig.3 XRD of Au and Cur-Au materials

2.1.4 Au、 Cur 和Cur-Au 的FTIR 分析圖4 為Cur、 Au、 Cur-Au 材料的紅外光譜圖分析圖。 由圖4可知, 三種材料的紅外譜圖除在2300 cm-1處出峰不一致外,其余出峰基本一致, 但Cur-Au 的紅外譜圖出峰強度增大, 特別是在1460 cm-1處明顯增強。 其中2300 cm-1處的出峰可能是由于硅烷偶聯劑修飾所引起的, 1460 cm-1處的出峰強度增強是由于姜黃素的引入引起的。

圖4 Au、 Cur 和Cur-Au 材料的紅外吸收光譜圖Fig.4 Infrared absorption spectra of Au, Cur and Cur-Au's materials

2.1.5 Au 及Cur-Au 材料的熱重圖分析

圖5 為Au 和Cur-Au 材料的熱重圖, 由圖5 可知, Au 材料在經過高溫灼燒后, 失重百分比由100%到93.73%, 熱重損失6.27%。 而Cur-Au 材料經過相同處理后, 失重百分比由100%到88.72%, 熱重損失11.28%, 考慮到由于負載姜黃素的熱損失影響, 對比簡單推算, 計算該載姜黃素Au 納米微球的載藥量為5.01%。

圖5 Au 和Cur-Au 材料的熱重圖Fig.5 Thermogravimetric diagram of Au and Cur-Au's materials

2.2 材料載藥和緩釋的性能分析

2.2.1 姜黃素乙醇溶液標準曲線的結果與分析

圖6 為姜黃素乙醇溶液標準曲線圖, 從圖6 可知, 其線性回歸方程為A=0.1534C+0.0208(R2= 0.9993), 姜黃素乙醇溶液的濃度在1 ～6 mg/L 之間線性關系良好。

圖6 姜黃素乙醇溶液的標準曲線圖Fig.6 Standard curve of curcumin ethanol's solution

2.2.2 Cur-Au 材料的包封率和載藥量分析

表1 為硅烷化修飾前后Au 納米微球包封率和載藥量的數據表, 由表1 可得, 硅烷化修飾后Cur-Au 納米微球包封率的平均值為9.097%, 載藥量的平均值為4.351%, 對比硅烷化修飾前的Au 納米微球, 其負載姜黃素的載藥量有明顯提高。

表1 硅烷化修飾前后Cur-Au 材料的包封率和載藥量(n=3)Table 1 Encapsulation and drug loading of Cur-Au before or after silanization (n=3)

2.2.3 材料的載藥緩釋性能分析

圖7 為Cur 和Cur-Au 納米微球的體外釋藥性能分析圖,由圖7 可知, 等質量的Cur 在1 h 處的釋放率為16.06%, 1 h后的釋放率快速增高, 有突釋現象, 在6 h 內基本完全釋放。而Cur-Au 納米微球在0.5 h 釋放率為2.35%, 6 h 僅為17.39%, 釋放率低, 釋放速度慢, 對比純姜黃素的突釋, Cur-Au 納米微球具有一定的緩釋作用。

圖7 Cur 和Cur-Au 材料的緩釋圖Fig.7 Sustained release diagram of Au and Cur-Au materials

3 結 論

實驗研究表明, 采用晶種生長法, 以HAuCl4為Au 源,CTAB 作為表面活性劑能夠制得形貌和粒徑較均勻的Au 納米微球, 經硅烷偶聯劑表面修飾后的Au 納米微球對姜黃素具有較好的載藥性能, 包封率和載藥量分別為9.097%和4.351%, 姜黃素體外釋放結果表明, 經修飾后的Au 納米微球作為載體具有較好的藥物緩釋作用, 可為今后進一步的體內外藥效試驗研究提供參考依據。