玉米ZmMYB2基因的克隆及表達分析

楊曉藝 王聰 鹿錦浩 呂紹芝 林海東 裴玉賀

摘要：為了研究MYB轉錄因子的功能及其對逆境脅迫的響應，本研究對玉米自交系遼3162三葉期幼苗進行干旱和鹽脅迫處理，克隆ZmMYB2基因并進行生物信息學分析，探究該基因在脅迫條件下的表達。該基因開放閱讀框長1233bp，編碼410個氨基酸，具有多個MYB轉錄因子結合位點，為MYB轉錄因子。經生物信息學分析推測ZmMYB2蛋白分子量為46.08kDa，等電點為6.38，屬于親水性酸性非分泌蛋白，具有2個MYB保守結構域，定位在細胞核內，與高粱、南荻的親緣關系較近。qRT-PCR結果表明，該基因在玉米葉片中的表達量最高，具有組織特異性，且能響應干旱和鹽等非生物脅迫。初步判斷該基因對玉米的非生物脅迫應答起著重要作用。

關鍵詞：玉米;ZmMYB2;基因克隆;脅迫應答;生物信息學分析;基因表達

MYB轉錄因子家族是一類DNA結合蛋白，在植物次生生長發育、細胞周期調控和抗逆生理等方面有著重要作用。1987年PazAres等從玉米中發現并克隆了植物中第一個參與花青素合成的MYB基因ZmMYB2C1[1]，此后隨著研究的深入，越來越多的該家族成員被挖掘出來。MYB轉錄因子家族成員具有相似的結構，完整的MYB蛋白由三部分組成：MYB結構域、轉錄激活結構域和負調控結構域。MYB結構域位于MYB蛋白的N-末端，含有約52個氨基酸殘基[2]。MYB蛋白通常包含1～4個保守的MYB結構域，根據MYB結構域的數量分為4類———1R-MYB、2RMYB、3R-MYB、4R-MYB[3]。其中2R-MYB中的R2R3-MYB蛋白是高等植物所獨有的，由在N端高度保守的MYB域和在C端高度可變的C端域組成[4]，具有多種功能，是目前研究最廣泛的MYB蛋白，僅在被子植物基因組中就有超過100個成員[5]。

盡管MYB蛋白顯示出高度的結構相似性，但來自不同物種或生物體的相似蛋白之間卻存在明顯的功能差異。例如，在煙草中過表達BpMYB4可以誘導一些木質素生物合成基因的表達，導致次生壁增厚[6]。在擬南芥中過表達AtMYB75基因也會導致木質素積累的輕微增加，參與木質素生物合成的調控;AtMYB3R1和AtMYB3R4基因可以激活KNOLLE基因的表達，從而在核分裂中起到積極的調節作用;AtMYB88和AtMYB124基因可以控制細胞周期和細胞分化過程;AtMYB24、AtMYB57、AtMYB80等基因對花藥和花粉粒的發育起重要作用[7]。RgMYB10基因能促進合成毛蕊花糖苷[8]，ZmMYB48能調控植物對干旱脅迫的防御[9]，ZmMYB268在植物抵御高溫方面起重要作用[10]。

本研究以玉米自交系遼3162幼苗為試材，對ZmMYB2基因進行克隆并進行生物信息學分析，通過模擬鹽脅迫和干旱脅迫，研究其在非生物脅迫下的表達情況，旨在為玉米抗逆育種提供基因資源，為探究MYB轉錄因子調控非生物脅迫的分子機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

取玉米自交系遼3162種植在青島農業大學培養室內，培養條件為（25±2）℃、16h光照/8h黑暗、相對濕度70%，培養至三葉一心時進行鹽和干旱脅迫處理，分別用250mmol/L的NaCl溶液和20%的PEG-6000溶液澆灌幼苗，分別在處理0、6、12、24、48h采集玉米幼嫩的根、莖、葉，于-80℃冰箱內保存備用。

1.2RNA提取及cDNA合成

使用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit（TaKaRa公司），從三葉期幼苗組織中提取RNA。用超微量分光光度計（Nanodrop2000，美國）對提取的總RNA濃度和純度進行檢測，同時用1%瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測RNA質量。采用HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進行cDNA第一鏈的合成。

1.3ZmMYB2基因的克隆

用PrimerPremier5.0軟件設計引物。以反轉錄產生的cDNA為模板，利用高保真酶進行PCR擴增，對PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收;將目的條帶與克隆載體pMD19-T進行連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，LB培養基復蘇后篩選出多個陽性克隆，選擇單菌落進行PCR擴增，選擇擴增出目標條帶的細菌溶液，送樣測序。

1.4ZmMYB2的生物信息學分析

通過NCBI搜索獲得基因基本信息，然后利用在線分析工具ExPASy、NetPhos3.1、SignalP4.1、SOPMA、TMHMM、PlantCARE等[11-15]對ZmMYB2蛋白的理化性質、磷酸位點、保守結構域、亞細胞定位、進化關系、二三級結構、啟動子順式作用元件等進行預測分析。

1.5熒光定量PCR

通過檢索獲得的ZmMYB2基因序列，設計cDNA快速擴增的上、下游引物（表1）。使用試劑盒ChamQTMUniversalSYBRqPCRMasterMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）在熒光定量PCR儀（QuantStudio3，美國ABI）上進行熒光定量PCR擴增。采用2-ΔΔCt方法[16]計算ZmMYB2基因在幼嫩根、莖、葉中的相對表達量及處理0、6、12、24、48h的相對表達量。使用MicrosoftExcel2010處理數據并進行差異顯著性分析和作圖。

2結果與分析

2.1ZmMYB2基因的克隆及鑒定

根據基因序列設計全長編碼區引物，以cDNA為模板對ZmMYB2進行PCR擴增，從玉米自交系遼3162中擴增出一條長度為1233bp的基因序列，用瓊脂糖凝膠電泳對RNA和目的基因序列進行驗證（圖1），根據ORFfinder可知該基因編碼410個氨基酸（圖2）。

2.2ZmMYB2的啟動子序列順式作用元件預測分析

從NCBI數據庫獲得ZmMYB2基因的啟動子前3000bp序列，使用在線軟件plantCARE對啟動子序列的順式作用元件進行預測，結果（表2）發現，在ZmMYB2基因上游不僅有CAAT-box、TATA-box等常見的核心啟動子元件，還發現了13個MYB轉錄因子結合位點，表明ZmMYB2具有啟動子驅動的功能，可能受玉米MYB家族成員的調控。

2.3ZmMYB2蛋白的理化性質分析

利用在線軟件ExPASy對ZmMYB2蛋白進行理化性質分析，結果（表3）顯示，ZmMYB2蛋白分子式為C2003H3157N589O636S13，由20種常見氨基酸組成，含量最高的為亮氨酸（Leu），占總含量的9.8%，谷氨酸（Glu）和絲氨酸（Ser）次之，占總含量的8.5%，色氨酸（Trp）含量最低，僅占0.5%;理論等電點為6.38，小于7，表明ZmMYB2蛋白是一個弱酸性蛋白;親水指數為-0.714，推測為親水性蛋白。利用在線工具ProtScale分析得到玉米ZmMYB2蛋白的親/疏水信號圖（圖3），其多肽鏈N端和C端皆表現為親水性，中間部位多數也表現為親水性，親水峰值在-0.5以下的信號明顯多于峰值在0.5以上的信號，進一步證明了ZmMYB2蛋白具有親水性。

2.4ZmMYB2蛋白的磷酸位點、信號肽、結構域預測及亞細胞定位

通過在線軟件NetPhos3.1分析可知，ZmMYB2蛋白可能存在46種磷酸化位點（圖4），分別為28個絲氨酸（Ser）位點、12個蘇氨酸（Thr）位點和6個酪氨酸（Tyr）位點，可以與磷酸基團結合，傳遞磷酸基團。利用在線軟件SignalP4.1和TMHMM對ZmMYB2蛋白進行信號肽和跨膜結構域預測，結果顯示ZmMYB2基因編碼的蛋白中不存在信號肽和跨膜結構域，從而推測ZmMYB2蛋白為非分泌蛋白，是在細胞內起作用的蛋白。根據在線工具CDSearch，查找ZmMYB2基因的保守結構域，結果（圖5）表明，ZmMYB2蛋白含有MYB-SHAQKYF和MYB-CC-LHEQLE兩個MYB域，推測ZmMYB2蛋白屬于MYB家族的轉錄因子。利用在線工具Plant-mPLoc對ZmMYB2蛋白進行亞細胞定位，結果表明ZmMYB2蛋白定位在細胞核中的可能性最大，推斷ZmMYB2蛋白最有可能在細胞核中起作用，是能夠與DNA特定片段結合調控下游基因表達的轉錄因子。

2.5ZmMYB2蛋白的二三級結構預測

利用在線工具SOPMA分析得知，ZmMYB蛋白的多肽鏈中多以無規則卷曲為主，含量為55.85%，其次為34.88%的α-螺旋，延伸鏈和β-折疊含量較少，各占7.07%和2.20%。利用在線工具SWISS-MODEL對ZmMYB2蛋白的410個氨基酸進行3D建模，模板覆蓋率為62.07%，得到ZmMYB2蛋白的三級結構（圖6）。

2.6ZmMYB2蛋白的序列對比和進化分析

利用在線工具DNAMAN6.0，以ZmMYB2基因序列為探針，按照最大似然法，將ZmMYB2蛋白序列與高粱（Sorghumbicolor）、南荻（Miscanthuslutarioriparius）、柳枝稷（Panicumvirgatum）、黍（Panicumhallii）、粟（Setariaitalica）、福尼奧小米（Digitariaexilis）、野生二粒小麥（Triticumdicoccoides）、秈稻（Oryzasativasubsp.indica）、大麥（Hordeumvulgare）等植物的MYB序列進行對比，結果（圖7）顯示MYB蛋白序列的重疊性較高，表明MYB轉錄因子具有較高的同源性，在進化過程中具有一定的保守性。采用DNAMAN6.0進行多序列比對，利用MEGA-X構建各植物蛋白的系統發育進化樹（圖8），發現ZmMYB2蛋白序列與高粱和南荻的MYB序列親緣關系最近，同屬高粱族，而與秈稻、野生二粒小麥和烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）的親緣關系最遠。

2.7ZmMYB2基因的表達分析

qRT-PCR分析ZmMYB2基因在不同組織中的表達，結果（圖9）顯示，ZmMYB2基因在玉米根、莖、葉中均有表達，但不同部位的表達量存在差異，根中的表達量最低，葉中最高，為根的3.88倍，莖中的表達量僅次于葉，為根的3.15倍，說明ZmMYB2基因的表達具有組織特異性。ZmMYB2基因在鹽脅迫和干旱脅迫0～48h的表達水平變化情況如圖10所示，可見，ZmMYB2基因的表達量在NaCl脅迫后呈現先降低后升高、處理48h后又顯著下降的變化趨勢;在模擬干旱處理下呈現升-降-升-降的波動趨勢，在處理的12h后顯著升高，24h時達到最高。推測ZmMYB2基因能夠響應NaCl和PEG脅迫。

3討論與結論

本研究從玉米中克隆出ZmMYB2基因，生物信息學分析結果表明該蛋白為弱酸性親水性非分泌蛋白，定位在細胞核內;上游序列中含有多個啟動子順式作用元件，具有多個轉錄因子結合位點，包括MYB轉錄因子結合位點;含有MYBSHAQKYF和MYB-CC-LHEQLE兩個保守結構域。說明ZmMYB2屬于MYB轉錄因子家族。

本研究發現，ZmMYB2基因主要在玉米葉片中表達，其次為莖中，在根中的表達量較低。與前人研究結果類似，如澳洲堅果MiMYB2基因主要在枝葉中表達，在花中的表達量較低[17];地黃RgMYB10基因主要在須根中表達，在塊根中的表達量較低[8]。Chen等利用擬南芥非生物脅迫反應MYB蛋白序列，通過比較基因組學，從玉米中鑒定到46個可能參與非生物脅迫的MYB基因，其中，轉ZmMYB30基因能夠提高擬南芥對鹽脅迫的耐受性，并能增加非生物脅迫相關基因的表達數目[18];胡育峰等研究發現在胚乳中過表達MYB14能夠提高玉米籽粒淀粉含量[19];TaMYB3R1、TaMYB1和TaMYBsdu1基因也在小麥干旱反應中起著重要作用，TaMYB2A、TaMYB3R1、TaPIMP1等基因通過抑制植物蛋白磷酸酶2C的表達來提高小麥耐鹽性[20];TaMYBsm3基因通過提高P5CS1、DREB2A、RD29A等非生物脅迫應答基因的表達水平來增強小麥抗旱性[21]。本研究發現，鹽脅迫和干旱脅迫均能使ZmMYB2基因表達量上調。綜合上述分析，可推斷MYB家族基因的表達具有組織特異性，并對植物抵御非生物脅迫起著重要的調控作用。

本研究結果可為進一步研究ZmMYB2基因的生物學功能以及玉米對非生物脅迫應答的分子機制奠定基礎。