m6A修飾酶METTL16在卵巢中的表達及其作用機理挖掘

Abdelkerim Barh Touna，董 瑩，楊志新，楊麗華

(昆明醫科大學第二附屬醫院 婦科，云南 昆明 650000)

卵巢癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，其致死率居婦科惡性腫瘤首位，嚴重威脅婦女生命和健康。N6-甲基腺苷酸(N6-methyladenosine，m6A)是mRNA和lncRNA中影響RNA代謝的一種重要修飾。甲基轉移酶樣蛋白16(methyltransferase16，METTL16，又名METT10D)是新近證實的一種m6A RNA甲基轉移酶，與胃癌[1]、肺癌[2]、前列腺癌[3]等多種癌癥的發生及發展有關，但未見其在卵巢癌中的研究報道。本研究通過收集Oncomine數據庫中關于METTL16在卵巢癌研究的相關數據集，對其進行探索，同時通過GEPIA、Kaplan-Meier等數據庫分析METTL16在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌患者生存的影響，隨后應用STRING、Metascape數據庫進一步探究METTL16共表達蛋白及其在卵巢癌發生發展中可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數據庫中提取METTL16在卵巢癌中表達的數據

登陸Oncomine數據庫頁面(http：//www.on-comine.org)，根據以下條件進行篩選：(1)Gen：METT10D；(2)Cancer Type：Ovarian cancer；(3)Data Type：mRNA；(4)Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5)臨界值設定(P<0.05)；Fold Change：All；Gene Rank：All。探索METTL16在卵巢癌中的差異表達情況。

1.2 GEPIA數據庫驗證METTL16在Oncomine數據庫中的表達結果及其表達水平與卵巢癌臨床病理分期的關系

進入GEPIA數據庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，設置限定條件：(1)Gene：METTL16；(2)p-value Cutoff：0.01；(3)Datasets Selection：OV；(4)匹配正態數據：匹配 TCGA 法線和 GTEx 數據。

1.3 應用Kaplan-Meier Plotter進行METTL16在卵巢癌中的生存分析

登錄Kaplan-Meier Plotter數據庫(http：//kmplot.com/analysis/)，選擇“start KM plotter for Ovarian cancer”選項卡，設置限定條件為(1)Gene symbol：METTL16(Affymetrix ID：226744_at)；(2)Survival：無進展生存期(progression-free survival，PFS)、總生存期(Overall survival，OS)。探索METTL16在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌患者生存的影響。

1.4 METTL16基因相關蛋白互作關系及富集分析

登錄STRING主頁，設置限定條件：(1)Protein Name：METTL16：(2)Organism：Homo sapiens，構建YTHDC1相關蛋白網絡圖。登陸Metacape(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，設置限定條件：(1)添加相關蛋白Gene Symbol；(2)Analysis as species：H.sapiens(121)進行相關蛋白富集分析。

2 結果

2.1 Oncomine數據庫中METTL16在卵巢癌中的表達

Oncomine數據庫中關于METTL16在卵巢癌中表達的相關研究主要有7項，與正常卵巢組織相比，METTL16在卵巢癌組織中呈現低表達，且差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 GEPIA數據庫中METTL16在卵巢癌中的表達及其表達水平與卵巢癌臨床病理分期的關系

GEPIA數據庫中進一步驗證METTL16在卵巢癌組織中的表達，分析了腫瘤組織426例，正常組織86例，METTL16在卵巢癌組織中呈現低表達，分期越晚表達越低，結果有統計學意義(P<0.05)，見圖2、圖3。

圖2：METTL16在卵巢癌組織中的表達

圖3 METTL16基因表達與卵巢癌臨床病理分期的關系

2.3 METTL16基因與卵巢癌患者的生存關系分析

在Kaplan-Meier 數據庫中進行卵巢癌患者生存分析，發現METTL16基因低表達組無病生存率、總生存率均顯著高于高表達組(P=0.00024)，見圖4。

圖4 METTL16表達卵癌患者生存分析

2.4 METT16相關互作蛋白及其富集分析

在STRING網站中構建METTL16基因相關蛋白互作網絡圖，METTL16主要相關蛋白有10個，分別為MEPCE，SGSM2，CLUH，METTL14，SRR，BRMS1L，SMG6，DCP1B，RBM34，METTL3，見圖5。將以上蛋白進行富集分析，主要富集在RNA甲基化和mRNA分解代謝過程，見圖6。

圖5 METTL16相關蛋白網絡關系圖

圖6 METTL16相關蛋白參與的富集過程

3 討論

m6A甲基化在卵巢癌的發生、發展、侵襲和耐藥性中起到重要作用[4]。METTL16 是人類細胞 RNA 修飾領域的新興參與者，最初被認為是一種核糖體 RNA 甲基轉移酶，現有研究顯示它可以結合并甲基化 MAT2A mRNA和 U6 snRNA[5]，另外METTL16還被證明可以結合 MALAT1 長鏈非編碼 RNA 和其他幾種 RNA[7]。本研究通過在Oncomine數據庫分析發現METTL16在卵巢癌中表達明顯低于正常組織，且這一結果在GEPIA數據庫中得到了驗證，同時，METTL16與卵巢癌臨床分期各組間有差異，臨床病理分期較早的卵巢癌中表達更高，且METTL16基因低表達者無病生存率及總生存率顯著升高，提示METTL16基因在卵巢癌可能發揮抑癌基因作用。為進一步探究METTL16在卵巢癌中的作用機理，我們發現MEPCE，METTL13等10個為METTL16的互作蛋白，進行富集分析后發現這些蛋白主要富集在RNA甲基化和mRNA分解代謝過程。對上述10個蛋白了解后發現，METTL16與METTL3同源，可以結合于U6 snRNA，導致U6 核微小核糖核蛋白顆粒(small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP發生m6A甲基化修飾，從而影響U6 snRNP對mRNA前體的剪接[6]，Ma Zhao[7]等人發現METTL3總體水平升高是子宮內膜樣上皮性卵巢癌患者生存期相關的獨立因素，Hua[8]等人發現METTL3通過促進AXL(Tyro3/Axl/Mer)的翻譯和上皮細胞-間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，在卵巢癌的發生發展和/或侵襲性中發揮重要的致癌作用，而我們的研究中，METTL3與METTL16互為互作蛋白，METTL16在卵巢癌中則表達為抑癌基因，因此二者可能對卵巢癌的發生發展起到互相拮抗的作用。

綜合以上結果及相關分析，本研究認為METTL16可能通過結合并甲基化mRNA和snRNA干預mRNA分解代謝過程，同時通過與METTL3互作蛋白相互拮抗，在METTL16高表達時通過干預RNA甲基化過程抑制METTL3的表達，使癌細胞增殖減緩從而發揮抑癌基因作用。METTL16作為新近證實的一種m6A RNA甲基轉移酶，其在卵巢癌中的作用機制、臨床意義等，還需要進一步的實驗來進行驗證。