PP2A在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及其與骨質(zhì)破壞的相關(guān)性

趙 香 魏曉麗 李曉輝 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江省佳木斯市 154000

中耳膽脂瘤是一種具有破壞性的非癌性病變，以角化鱗狀上皮異常生長為特性[1]，由囊性成分、基質(zhì)和基質(zhì)周組織組成。中耳膽脂瘤最重要和最具破壞性的特征是進(jìn)行性的骨質(zhì)破壞，造成一系列顱內(nèi)外并發(fā)癥。中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞機(jī)制主要有破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)活化、壓力壞死、酸溶解、酶介導(dǎo)、炎癥介質(zhì)作用等[2]。大多數(shù)研究認(rèn)為，在中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞過程中，OC起到終末功能細(xì)胞的作用，破骨細(xì)胞活化因子(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)在OC的激活和成熟過程中起著尤為關(guān)鍵的作用[2]。有研究表明，蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)可通過激活RANKL誘導(dǎo)的NF-κB信號通路，促進(jìn)OC的生成和相關(guān)表達(dá)[3]。多項(xiàng)研究還證明，PP2A的異常表達(dá)與多種溶骨性疾病密切相關(guān)，如假體周圍骨溶解、肺癌及乳腺癌等。故本文選取PP2A來作為切入點(diǎn)，分析與膽脂瘤骨質(zhì)破壞存在的聯(lián)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 30例膽脂瘤組標(biāo)本取自2019年9月—2020年10月我院耳鼻咽喉科行乳突根治術(shù)或中耳探查術(shù)患者。其中男13例，女17例，年齡22～64歲，平均年齡49.83歲，病程6個(gè)月～50年。所選患者術(shù)后均病理診斷為中耳膽脂瘤。同時(shí)，手術(shù)中取15例患者耳后切口處正常皮膚作為對照組，其中男7例，女8例，年齡22～64歲，平均年齡45.27歲，病程6個(gè)月～50年。依據(jù)Hamed評分法將膽脂瘤組分為骨破壞組16例(得分≥4分)和未破壞組14例(得分0～3分)。

1.2 試劑 兔抗人PP2A單克隆抗體，免疫組化實(shí)驗(yàn)PV-8000-Vision試劑盒，DAB顯色試劑盒。

1.3 主要方法

1.3.1 石蠟切片制備：所有標(biāo)本取材后2h內(nèi)固定(10%的中性福爾馬林溶液)，脫水(梯度乙醇)，透明(二甲苯)，浸蠟，包埋；放置于4℃恒溫冰箱中冷藏待用。后期使用切片機(jī)以4μm厚度切片；烤片，制得石蠟切片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)：將石蠟切片浸入二甲苯脫蠟，再浸入梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗，PBS液沖洗；檸檬酸高溫高壓修復(fù)3min，待切片自然冷卻后，PBS沖洗；3%過氧化氫去離子水孵育15min，PBS沖洗；放濕盒畫圈(保持不干片，邊畫邊用PBS液沖洗)，甩干擦凈后滴加山羊血清，室溫孵育30min，傾去，勿洗；滴加一抗(工作濃度為1∶100)，放入37℃烤箱2h；取出切片置于室溫10min后 PBS沖洗；滴加二抗，室溫孵育20min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下控制背景，顯色3min左右；放入蒸餾水中終止染色，用自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染15min，自來水沖洗；分化，自來水沖洗5min；返藍(lán)(EDTA液)10min；自來水沖洗，行梯度乙醇脫水，烤片，二甲苯透明，中性樹膠封片。上述步驟中用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，以排除非特異性著色。

1.4 結(jié)果判定 將膽脂瘤上皮和正常耳后皮膚上皮層分為基底層、 顆粒層、 棘細(xì)胞層與角質(zhì)層。以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽性標(biāo)準(zhǔn)。評分方法：先按染色強(qiáng)度計(jì)分，0分為無染色，1分為弱棕黃色，2分為中等強(qiáng)度棕黃色，3分為深棕色；然后每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算5個(gè)視野的陽性細(xì)胞的平均百分比，按照百分比計(jì)分，沒有細(xì)胞著色為0分，<20%細(xì)胞著色為1分，21%≤細(xì)胞著色≤50%細(xì)胞著色為2分，>50%細(xì)胞著色為3分；兩項(xiàng)得分結(jié)果相加后分為四級：0、1為(-)，2為弱陽性(+)，3為陽性(++)，≥4為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料的差異用秩和檢驗(yàn)，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PP2A在膽脂瘤組和對照組的表達(dá)情況 膽脂瘤組中PP2A分布于中耳膽脂瘤上皮全層，無明顯強(qiáng)弱趨勢，主要表達(dá)于細(xì)胞核，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)(見圖1)，陽性表達(dá)以強(qiáng)陽性和中陽性居多，陽性率為83.3%。而在對照組中PP2A多為陰性表達(dá)(見圖2)，陽性率僅為26.7%。兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.650，P<0.01)，見表1。

圖1 PP2A在中耳膽脂瘤中的表達(dá)(IHC ×400) 圖2 PP2A在正常皮膚中表達(dá)(IHC ×400)

表1 膽脂瘤組和對照組PP2A的表達(dá)

2.2 PP2A在骨破壞組及未破壞組中的表達(dá)情況 骨質(zhì)破壞組和未破壞組PP2A表達(dá)水平見表2，16例骨破壞組中PP2A表達(dá)強(qiáng)陽性者有10例，而14例未破壞組中僅有1例PP2A強(qiáng)陽性表達(dá)，骨破壞組中PP2A表達(dá)水平較未破壞組明顯增強(qiáng)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

表2 骨破壞組和未破壞組PP2A的表達(dá)

中耳膽脂瘤其危險(xiǎn)性主要是對骨質(zhì)的廣泛破壞。研究表明，破骨細(xì)胞的浸潤程度與中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞程度呈正相關(guān)，破骨細(xì)胞在骨質(zhì)破壞過程中作為末端效應(yīng)細(xì)胞，通過RANKL誘導(dǎo)的NF-κB信號通路而被激活[4]。

近年來，多項(xiàng)研究表明，PP也參與了膽脂瘤的形成。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PP2A不僅參與了細(xì)胞增殖及凋亡、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾、癌基因轉(zhuǎn)化等細(xì)胞活動(dòng)過程，還和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，PP2A在人假體周圍膜和鼠鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解模型中高度表達(dá)，抑制PP2A表達(dá)可通過強(qiáng)烈阻斷RANKL誘導(dǎo)的NF-кB信號通路抑制破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞相關(guān)表達(dá)，減輕骨質(zhì)破壞。Okamura H等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)基中，PP2A可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)參與破骨細(xì)胞形成。另外，Ricarte FR等[7]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素及其類似物可通過PP2A信號調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)。

本文結(jié)果顯示，與正常耳后皮膚相比，PP2A在中耳膽脂瘤上皮呈現(xiàn)中高表達(dá)。此外，筆者通過對中耳膽脂瘤骨破壞組和未破壞組PP2A表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PP2A在膽脂瘤上皮骨破壞組中陽性表達(dá)要高于未破壞組，這說明PP2A很有可能參與了中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞過程。結(jié)合以往的研究與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果筆者推測，在中耳膽脂瘤中，PTHrP高表達(dá)可能是引起PP2A高表達(dá)的原因之一。此外，PP2A水平的升高可能引起了RANKL的高表達(dá)，激活了NF-κB信號通路，促進(jìn)OC的生成和相關(guān)表達(dá)，導(dǎo)致膽脂瘤周邊的骨質(zhì)受到破壞。另外，多項(xiàng)研究證明，PP2A是一種腫瘤抑制因子，其表達(dá)降低或失活是腫瘤轉(zhuǎn)化的特征[6]。

綜上所述，PP2A在中耳膽脂瘤中高表達(dá)并且極有可能參與了膽脂瘤骨質(zhì)破壞的過程，為研究中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞機(jī)制提供了新的方向，為今后在中耳膽脂瘤中PP2A的研究奠定一定基礎(chǔ)，同時(shí)，對研發(fā)膽脂瘤臨床治療藥物有一定的意義。