銀杏黃酮在紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚損傷和老化中的作用

徐晶晶　　柯月琴　　戴曉燕　　周瑜　　舒國斌　　童世紅

[摘要] 目的 探究銀杏黃酮在紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚損傷和老化中的作用。方法 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常組、模型組和銀杏黃酮20 mg/L組、40 mg/L組、80 mg/L組。結(jié)果 與正常組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高細(xì)胞活力（P<0.05）。與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），線粒體膜電位顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低細(xì)胞凋亡率（P<0.05），顯著升高線粒體膜電位（P<0.05）。結(jié)論 銀杏黃酮對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞損傷具有保護(hù)和延緩光老化的作用。

[關(guān)鍵詞] 銀杏黃酮;紫外線輻射;皮膚老化;氧自由基

[中圖分類號(hào)] R751? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）08-0012-04

Role of ginkgo flavonoids in ultraviolet radiation-induced skin injury and aging

XU Jingjing1 KE Yueqin1? ?DAI Xiaoyan2? ?ZHOU Yu3? ?SHU Guobin1? ?TONG Shihong4

1.Department of Dermatology， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China; 2.Outpatient Infusion Room， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China; 3.Department of Clinical Laboratory， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China; 4.Stoma Wound Care Specialist Clinic， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China

[Abstract] Objective To investigate the role of ginkgo flavonoids in ultraviolet radiation-induced skin injury and aging. Methods The experimental subjects were randomly divided into the normal group， the model group， ginkgo flavonoids 20 mg/L group， ginkgo flavonoids 40 mg/L group， and ginkgo flavonoids 80 mg/L group. Results Compared with the normal group， the cell viability in the model group was significantly decreased （P<0.05）; compared with the model group， the cell viability in the ginkgo flavonoids group significantly was increased （P<0.05）. Compared with the normal group， the apoptosis rate of the model group was significantly increased （P<0.05）， and the mitochondrial membrane potential in the model group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the apoptosis rate of the ginkgo flavonoids group was significantly decreased （P<0.05）， and the mitochondrial membrane potential of the ginkgo flavonoids group significantly increased （P<0.05）. Conclusion Ginkgo flavonoids have a protective effect on skin fibroblast injury induced by ultraviolet radiation and delays photoaging.

[Key words] Ginkgo flavonoids; Ultraviolet radiation; Skin aging; Oxygen free radicals

皮膚是機(jī)體應(yīng)對(duì)外界物理、化學(xué)和環(huán)境污染物的首要防御屏障[1]。多種環(huán)境因素作用于皮膚病的發(fā)生，其中日光紫外線輻射是引起皮膚病的一個(gè)重要因素。近年來由于自然環(huán)境破壞，紫外線輻射日益加劇，由此引起的皮膚病發(fā)病率逐年增高。銀杏葉提取物以銀杏的葉子為原料，該產(chǎn)品作用包括促進(jìn)血液循環(huán)、抗氧化、抗衰老、抗癡呆、降低血壓、改善糖尿病等。有研究表明，銀杏黃酮在臨床上已用于心腦疾患等多種疾病的治療[2-3]，而對(duì)拮抗皮膚老化是否有明確的意義尚不明了。本實(shí)驗(yàn)旨在探討銀杏黃酮在紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚損傷和老化中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥品

人皮膚成纖維細(xì)胞購自中國科學(xué)院典藏細(xì)胞庫。銀杏黃酮購自深圳市思美泉生物科技有限公司，貨號(hào)90045-36-6，純度>99%。

1.2 方法

1.2.1 分組? 體外培養(yǎng)人體正常皮膚成纖維細(xì)胞，隨機(jī)分為正常組、模型組和銀杏黃酮20 mg/L組、40 mg/L組、80 mg/L組。除正常組外，其余各組經(jīng)紫外線（使用UVA+UVB同時(shí)照射，照射總量為UVA：4.2 J/cm2;UVB：0.5 J/cm2）照射，在不同時(shí)間段（0、3、12、48 h）分別收集細(xì)胞并保存。

1.2.2? MTT檢測(cè)細(xì)胞活力? 細(xì)胞培養(yǎng)，每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位水平? ? 各組細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)接種于24孔板中。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

取500 μl單細(xì)胞懸液，加入Rhodamine 123染液10 μl，37℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)507 nm，計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞，測(cè)定單個(gè)細(xì)胞熒光，用Rhodamine 123的熒光強(qiáng)度變化表示細(xì)胞線粒體膜電位。

1.2.4 細(xì)胞老化相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性測(cè)定? 各組細(xì)胞按照5.0×104個(gè)ml的細(xì)胞密度接種，用40 g/L多聚醛固定細(xì)胞45 min，用X-Gal染液在37℃保溫4～8 h，再固定4 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。確定細(xì)胞老化相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)? 各組細(xì)胞均提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s;72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)? 提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF上;分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜;再加入二抗室溫孵育2 h，后在暗室中曝光顯影，再定影，將膠片用Quantity One軟件分析各蛋白條帶蛋白表達(dá)。

1.2.7 熒光分析法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量? 在Tris-HCl緩沖溶液中，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超OH、NO和有熒光效率的自氧化產(chǎn)物。在433.0 nm激發(fā)波長(zhǎng)和494.5 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較

與正常組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位比較

與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高、線粒體膜電位水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低細(xì)胞凋亡率，顯著升高線粒體膜電位水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組細(xì)胞β-半乳糖苷酶的活性比較

與正常組比較，模型組β-半乳糖苷酶的活性染色陽性率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低β-半乳糖苷酶的活性染色陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組基因表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組Bcl-2、iNOS mRNA表達(dá)顯著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2 mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高Bcl-2、iNOS mRNA表達(dá)，顯著降低Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2 mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

2.5 各組蛋白表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組Bcl-2、iNOS蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高Bcl-2、iNOS蛋白表達(dá)，顯著降低Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

2.6 各組細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量比較

與正常組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表6。

3 討論

皮膚老化是由于紫外線長(zhǎng)期輻射后，導(dǎo)致皮膚質(zhì)量下降[4-5]。UVB照射可導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)皺紋、色素沉著、松弛等光老化現(xiàn)象[6-7]。UVA作用于細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生ROS。高水平的ROS引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，影響CD95/CD95L凋亡通路和多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá);同時(shí)活化細(xì)胞內(nèi)的ROS，啟動(dòng)線粒體的去極化，使線粒體膜通透性增加，出現(xiàn)皮膚光老化[8-9]。

藥理學(xué)研究表明，銀杏葉提取物具有改善血液循環(huán)、降低心肌耗氧量、保護(hù)心腦血管、提高機(jī)體免疫功能等作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人皮膚細(xì)胞損傷和老化后細(xì)胞活力顯著降低;而銀杏黃酮可以提升損傷細(xì)胞的活力。高陽等[12]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮處理后細(xì)胞存活率顯著提升。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，人皮膚細(xì)胞損傷和衰老后，β-半乳糖苷酶的活性染色陽性率顯著提高，但銀杏黃酮可顯著降低β-半乳糖苷酶表達(dá)。葛志華等[13]研究表明，衰老大鼠下頜下腺β-半乳糖苷酶表達(dá)增加，凋亡細(xì)胞數(shù)較正常組明顯增多。

趙麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮苷元可以下調(diào)Bax基因表達(dá)，上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)。黎小瓊[15]研究表明，CD95、CD95L廣泛表達(dá)于多種上皮細(xì)胞的表面。陳志國等[16]研究表明，CD95/CD95L在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于良性疾病組及正常胃黏膜組。竇婷婷[17]研究表明，pttg1在皮膚腫瘤中的表達(dá)顯著高于正常水平。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人皮膚細(xì)胞損傷和衰老后，Bcl-2基因和蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD基因和蛋白表達(dá)顯著升高，但銀杏黃酮可顯著改善損傷和衰老。

銀杏黃酮類成分是銀杏葉提取物具有獨(dú)特藥理活性的藥效成分，具有抗氧化、清除自由基等功能[18-19]。清除自由基和活性氧，主要體現(xiàn)在抑制細(xì)胞內(nèi)COX-2和iNOS的活性[20]。本研究表明，人皮膚細(xì)胞損傷后細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量顯著升高、iNOS基因和蛋白表達(dá)顯著降低、COX-2基因和蛋白表達(dá)顯著升高;而不同濃度的銀杏黃酮顯著降低細(xì)胞內(nèi)OH、NO含量，顯著升高iNOS基因和蛋白表達(dá)，顯著降低COX-2基因和蛋白表達(dá)。

綜上所述，銀杏黃酮對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞損傷具有保護(hù)和延緩光老化的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?Ebi KL，McGregor G. Climate change，tropospheric ozone and particulate matter，and health impacts[J].Environ Health Perspect，2008，116（11）：1449-1455.

[2]? ?謝威義.銀杏葉提取物治療非動(dòng)脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變的臨床療效分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2018，56（9）：73-75.

[3]? ?葛茸茸，沈煒.銀杏黃酮靶蛋白信號(hào)通路介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2誘導(dǎo)的后發(fā)性白內(nèi)障的分子機(jī)制研究[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（6）：497-499.

[4]? ?吳斯敏，楊慧齡.紫外線引起皮膚光老化機(jī)制及防治的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（2）：341-346.

[5]? ?王小燕，劉子菁，馬仁燕，等.皮膚光老化研究新進(jìn)展[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2019，35（5）：305-308，312.

[6]? ?陳琳.射頻聯(lián)合點(diǎn)陣激光治療面部皮膚光老化的臨床療效及應(yīng)用價(jià)值[J].現(xiàn)代診斷與治療，2017，8（14）：124-125.

[7]? ?秦鋒，張文超，張明子，等.脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞治療皮膚老化的研究進(jìn)展[J].中國美容整形外科雜志，2020， 31（4）：244-246，253.

[8]? ?王繼慧.絞股藍(lán)總皂苷對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型凋亡信號(hào)通路的影響[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[9]? ?梁書旗，吳新軍，李巖，等.LncRNA ROR在脂肪源性干細(xì)胞中的過表達(dá)對(duì)面部皮膚老化的影響[J].分子診斷與治療雜志，2021，13（4）：619-622.

[10]? 涂清波，孫云，許婷，等.銀杏雙黃酮藥理作用的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2018，58（19）：112-114.

[11]? 龔婕，馬良娟.皮膚光老化和抗氧化劑研究進(jìn)展[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2019，35（11）：692-695.

[12]? 高陽，康凱，王慧.銀杏黃酮對(duì)缺氧復(fù)氧心肌H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].遵義醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019， 42（5）：539-542.

[13]? 葛志華，孫立新，李俊玫，等.實(shí)驗(yàn)性衰老大鼠下頜下腺β-半乳糖苷酶、TUNEL的改變[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，24（2）：125-127.

[14]? 趙麗，何艷，劉興德. 銀杏黃酮苷元對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2014，30（6）：546-549.

[15]? 黎小瓊.CD95/CD95L促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和炎癥的作用[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[16]? 陳志國，王正文，譚順.胃癌組織中CD95/CD95L的表達(dá)[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（8）：752.

[17]? 竇婷婷.垂體瘤轉(zhuǎn)化基因-1（PTTG1）在銀屑病及皮膚腫瘤中的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2015.

[18]? 李保同，徐永霞，李娟，等.纖維素酶-微波輔助提取銀杏葉總黃酮及抗氧化性能研究[J].現(xiàn)代化工，2016，36（3）：67-70.

[19]? 楊翠娥，王慧.銀杏黃酮對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的保護(hù)作用[J].卒中與神經(jīng)疾病，2019，26（6）：660-663.

[20]? 張兆敏，楊睿，高成巖，等.銀杏黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2018，19（1）：43-44.

（收稿日期：2021-04-01）