烏頭湯、四妙散對膠原誘導性關節炎DBA/1小鼠的作用研究

鄭權發　張宇　陳芳　聶晶　于莨鑒　曾光

〔摘要〕 目的 研究中醫“散寒除濕”和“清熱祛濕”兩種治法的代表方烏頭湯和四妙散分別對膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis， CIA）DBA/1小鼠的白細胞介素-17 （interleukin-17， IL-17）、轉化生長因子-β （transforming growth factor β， TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）表達的影響，從“以方測證”角度探討DBA/1小鼠CIA模型的中醫證候屬性。 方法 復制DBA/1小鼠CIA模型，將造模成功的小鼠隨機分為模型組、烏頭湯低劑量組、烏頭湯高劑量組、四妙散低劑量組、四妙散高劑量組、甲氨蝶呤組，另設一組空白組，每組6只，連續給藥35 d。觀察記錄關節炎指數的變化，ELISA法檢測血清中IL-17、TGF-β及TNF-α的含量水平，免疫組化法檢測炎癥關節組織中IL-17、TGF-β及TNF-α的表達。結果 與空白組比較，模型組關節炎指數評分明顯升高（P<0.01）;模型組關節滑膜增生明顯，軟骨表面組織變性、壞死;關節組織、血清中IL-17、TNF-α、TGF-β表達顯著增高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，從第21天起給藥組關節炎指數評分明顯下降（P<0.05或P<0.01）;關節滑膜增生、關節軟骨表面損傷減輕;烏頭湯低/高劑量組、四妙散高劑量組、甲氨蝶呤組關節組織中IL-17、TNF-α、TGF-β表達明顯降低（P<0.05或P<0.01）;烏頭湯高劑量組、四妙散低/高劑量組、甲氨蝶呤組血清中IL-17、TNF-α表達明顯降低（P<0.05或P<0.01）。各給藥組之間相比較：與烏頭湯高劑量組比較，甲氨蝶呤組、烏頭湯低劑量組、四妙散低劑量組IL-17表達明顯升高（P<0.05或P<0.01）;烏頭湯低劑量組TNF-α表達升高（P<0.05），其余均無統計學差異。結論 烏頭湯及四妙散給藥均能改善CIA小鼠模型的癥狀。對相關炎癥因子的抑制，可能是烏頭湯及四妙散的作用機制之一，推測DBA/1小鼠CIA模型或許兼有“寒痹”與“熱痹”的屬性。

〔關鍵詞〕 膠原誘導性關節炎;四妙散;烏頭湯;白細胞介素-17;轉化生長因子-β;腫瘤壞死因子-α;中醫證候

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.008

Effects of Wutou Decoction and Simiao Powder on collagen-induced arthritis DBA/1 mice

ZHENG Quanfa1， ZHANG Yu1， CHEN Fang2， NIE Jing3， YU Langjian1， ZENG Guang1*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering，

Central South University， Changsha， Hunan 410083， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of the two representative methods of "dispersing cold and removing dampness"

and "clearing heat and removing dampness" in traditional Chinese medicine （TCM） Wutou Decoction and Simiao Powder on the expression of interleukin-17 （IL-17）， transforming growth factor-β （TGF-β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in DBA/1 mice with collagen-induced arthritis （CIA）， and to explore the attribute of TCM syndrome of CIA model of DBA/1 mice from the angle of “measuring symptoms and signs with prescriptions”. Methods CIA model of DBA/1 mice was replicated， the successful modeling mice were randomly divided into model group， Wutou Decoction low-dose group， Wutou Decoction high-dose group， Simiao Powder low-dose group， Simiao Powder high-dose group and methotrexate group， another blank group was set up， with 6 mice in each group. After 35 consecutive days of drug administration， the changes of arthritis index were observed and recorded. The content levels of IL-17， TGF-β and TNF-α in serum were detected by ELISA， and the expression levels of IL-17， TGF-β and TNF-α in inflammatory joint tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the blank group， the arthritis index score of the model group was significantly increased （P<0.01）， and there was significant synovial hyperplasia， as well as degeneration and necrosis of cartilage surface tissues. The expression levels of IL-17， TNF-α and TGF-β in the joint tissue and serum were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with the model group， the arthritis index score of the medication administration

group decreased significantly from the 21st day （P<0.05 or P<0.01）; synovial hyperplasia of joints， and alleviation of surface damage of articular cartilage were observed. The expression levels of IL-17， TNF-α and TGF-β in the joint tissues of the low-dose and high-dose groups of Wutou Decoction， the Simiao Powder high-dose group and methotrexate group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The expression levels of IL-17 and TNF-α in the serum of the Wutou Decoction high-dose group and the low-dose， high-dose groups of Simiao Powder and methotrexate group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared between medication administration group： compared with Wutou Decoction high-dose group， the expression of IL-17 in methotrexate group， Wutou Decoction low-dose group and Simiao Powder low-dose group was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）; the expression of TNF-α was increased in Wutou Decoction low-dose group （P<0.05）， and there was no significant difference in other groups. Conclusion Both Wutou Decoction and Simiao Powder can improve the symptoms of CIA mice model. The inhibition of inflammatory factors may be one of the mechanisms of action of Wutou Decoction and Simiao Powder. It is speculated that CIA model of DBA/1 mice may have both “cold arthromyodynia” and “heat arthromyodynia” properties.

〔Keywords〕 collagen-induced arthritis; Simiao Powder; Wutou Decoction; interleukin-17; transforming growth factor-β; tumor necrosis factor-α; TCM syndrom

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是難治性自身免疫性疾病之一，其基本病理改變為血管翳形成與滑膜增生，造成軟骨下骨質及關節軟骨的損壞和侵蝕，致畸率極高，嚴重影響患者的生活質量[1]。以甲氨蝶呤為基礎的多種抗風濕藥聯合、中西藥聯合治療是目前臨床主要治療手段[2]。

RA屬于中醫學“痹證”范疇。王建等[3]采集全國18家研究中心1602例類風濕關節炎患者信息的多中心橫斷面調查研究發現，RA中醫證候分布特點為：濕熱痹阻證比例最高，其他依次為寒濕痹阻證、肝腎不足證、痰瘀痹阻證、風濕痹阻證、氣血不足證。而四妙散與烏頭湯，分別是濕熱痹阻證、寒濕痹阻證的常用方，也是中醫“清熱祛濕”和“散寒除濕”治法的代表方，目前廣泛應用于臨床治療風濕性疾病[4-6]。本課題通過復制膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis， CIA）模型DBA/1小鼠，探討散寒除濕的代表方烏頭湯、清熱祛濕的代表方四妙散分別對CIA小鼠的治療作用及分子機制。從CIA小鼠的關節炎指數評分、關節病理形態、血清及炎癥關節組織中白細胞介素-17 （interleukin-17， IL-17）、轉化生長因子-β （transforming growth factor-β， TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的表達，觀察烏頭湯、四妙散對DBA/1小鼠CIA模型的療效，探討DBA/1小鼠CIA模型的中醫證候屬性，從而進一步闡釋中醫寒、熱不同治法治療“痹癥”的科學內涵。

1 材料

1.1? 動物

5周齡雄性DBA/1小鼠54只;體質量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司;實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2014-0012;湖南斯萊克景達動物倫理委員會，倫理審查編號：IACUC-SJA19029。飼養于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司SPF級動物實驗室。

1.2? 試劑與藥品

牛Ⅱ型膠原（批號：190306，美國Chondrex）;弗氏完全佐劑（批號：190208，美國Chondrex）;甲氨蝶呤片[批號：H31020644，規格：2.5 mg×100片，上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠];烏頭湯免煎顆粒、四妙散免煎顆粒（批號：9060021、9060022，廣東一方制藥有限公司）。

1.3? 儀器

玻璃微量注射器（瑞士Hamilton公司，250 μL）;Basile 37140足腫測定儀（意大利 UGO公司）;5810R型高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司）;動物永久標記儀（AIMS 公司）;ATY224型電子天平（日本島津公司）;CDS9000型動物氣體麻醉機（美國 Surgi Vet公司）;YJD13-GL型自動煎藥機（北京東華原醫療設備責任有限公司）;ECLIPSE Ci-L型生物正置顯微鏡、DS-1600型成像系統（株式會社尼康）。

2 方法

2.1? DBA/1小鼠CIA模型的復制

取54只DBA/1雄性小鼠，隨機選取6只作為空白對照組，其余48只小鼠均復制CIA模型：將溶于乙酸的牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化制成Ⅱ型膠原乳劑。于小鼠的尾根部單點注射，每只0.2 mL。以初次免疫作為第1天，第21天在相同的位置再次使用相同劑量增強免疫[7]，DBA/1小鼠在第二次增強免疫后第7天進行關節炎指數（arthritis index， AI）評分，累計總分大于4分或者單個肢體評估超過2分則視為造模成功[8]，共成功42只。

2.2? 動物分組與給藥

篩選出36只CIA模型小鼠，隨機分為模型組、烏頭湯低劑量組、烏頭湯高劑量組、四妙散低劑量組、四妙散高劑量組、甲氨蝶呤組，每組各6只。模型復制成功后開始灌胃，烏頭湯的成人每日劑量：川烏6 g，麻黃、黃芪、白芍、炙甘草各9 g，小鼠每日灌胃給藥的劑量7.5 g/kg（低劑量組，臨床等效劑量的2倍）和15 g/kg（高劑量組，臨床等效劑量4倍）。四妙散的成人每日劑量：黃柏12 g，牛膝12 g，蒼術12 g，薏苡仁30 g。小鼠每日灌胃給藥的劑量為6 g/kg（低劑量組，臨床等效劑量的2倍）和12 g/kg（高劑量組，臨床等效劑量4倍）。空白組和模型組小鼠分別給予等體積生理鹽水灌胃，甲氨蝶呤組每日灌胃給藥的劑量為0.33 mg/kg。給藥第35天，各組小鼠麻醉，進行腹主動脈取血，3500 r/min離心15 min得血清，-80 ℃保存，取小鼠右足關節組織，4%甲醛溶液固定，待檢測。

2.3? 指標觀察與檢測

2.3.1? 小鼠一般情況和發病時間? 第2次增強免疫后每日觀察小鼠進食、大小便、精神狀態及一般活動情況至確認模型復制成功;觀察記錄小鼠體質量變化;每日觀察各組小鼠發病情況，并記錄開始發病時間。

2.3.2? AI評分? 從給藥第1天起，每隔7 d對各組小鼠關節炎狀況進行1次評分，并評估結果，具體評分標準如下[8]：無紅腫計0分，趾關節稍腫計1分，趾關節及足趾關節腫脹計2分，踝關節以下足爪腫脹計3分，包括踝關節在內的全部足爪腫脹計4分。每只小鼠最高積累評分為16分。

2.3.3? ELISA法檢測外周血炎癥因子含量? 室溫平衡20 min后從鋁箔袋中取出所需板條，設置空白孔、標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL;樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物（horseradish peroxidase， HRP）酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置l min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL。37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD值。

2.3.4? 關節組織病理檢測方法? 動物犧牲后剪下右后足炎癥膝關節組織，福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣液中脫鈣21 d，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，脫蠟，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色，封片。100倍光學顯微鏡下觀察關節滑膜、軟骨和骨病理改變，以及滑膜血管增生情況。

2.3.5? 免疫組化檢測關節組織IL-17、TNF-α、TGF-β的表達情況? 切片常規脫蠟、水化后，緩沖液洗2次，每次3 min，將切片放在過氧化氫阻斷劑（hydrogen peroxide block）中孵育10～15 min，緩沖液洗2次，每次5 min，滴加ultra V block（酶標一抗），在室溫下孵育5 min以封閉非特異性的背景染色，緩沖液洗2次，每次5 min，滴加一抗工作液37 ℃孵育1.5 h，緩沖液洗2次，每次5 min，滴加primary antibody enhancer（增強子），在室溫下孵育20 min，緩沖液洗2次，每次5 min，滴加HRP polymer（酶標二抗），在室溫下孵育30 min，緩沖液洗2次，每次5 min，向1 mL DAB plus substrate中滴加1～2滴DAB plus chromogen，混勻后滴加到切片上，孵育3～15 min，自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。用Image-Pro Plus 6.0圖像處理分析系統進行圖像分析，結果以累積光密度（IOD=陽性表達面積×平均光密度）表示，數值越大則陽性表達越多。

2.4? 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對實驗所得數據進行統計學處理，計量資料以“x±s”表示，組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊則用Kruskal-Wallis H檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著性統計學意義。

3 結果

3.1? CIA小鼠的一般情況

模型復制成功后，與空白組比較，各組CIA小鼠出現不同程度體質量增長緩慢，精神萎靡，喜扎堆，毛發枯黃，飲食、飲水、活動量減少，關節先后出現紅腫。開始給藥后，空白組小鼠體質量穩定增長，其余組CIA小鼠體質量增長依舊緩慢，甚至出現體質量持續下降現象，體質量下降階段主要在第14～28 d期間。見圖1。

3.2? 烏頭湯、四妙散對CIA小鼠AI評分的影響

與空白組比較，第7、14、21、28、35 天模型組和各給藥組關節出現不同程度腫脹，AI評分明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，從給藥第21天開始，給藥組小鼠AI評分與模型組出現差異，給藥組小鼠AI評分明顯下降（P<0.05或P<0.01），且隨著給藥時間的延長，AI評分差異越明顯。其余給藥組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1和圖2。

3.3? 烏頭湯、四妙散對CIA小鼠關節組織病理變化的影響

組織病理學檢查顯示，空白組小鼠關節結構正常，滑膜組織無充血水腫，關節軟骨表面光滑平整（圖3A）。模型組小鼠滑膜細胞增生明顯，可見炎癥細胞大量浸潤，增生滑膜組織表面形成絨毛狀，向軟骨面爬行形成血管翳。軟骨表面組織變性、壞死（圖3B）。各給藥組小鼠關節滑膜有部分增生，有少量炎癥細胞浸潤，關節軟骨表面損傷較輕，見圖3C-G。

3.4? 烏頭湯、四妙散對CIA小鼠關節組織中IL-17、TNF-α、TGF-β表達的影響

右足關節組織切片經免疫組化處理并進行圖像分析后（圖4），與空白組比較，模型組小鼠關節組織中IL-17、TNF-α、TGF-β表達顯著增高（P<0.01）。與模型組比較，烏頭湯低/高劑量組、四妙散低/高劑量組、甲氨蝶呤組IL-17、TNF-α表達均降低（P<0.01或P<0.05）;烏頭湯低/高劑量組、四妙散高劑量組、甲氨蝶呤組TGF-β表達降低（P<0.05）。各給藥組之間相比較，關節組織中IL-17、TNF-α、TGF-β表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

3.5? 烏頭湯、四妙散對CIA小鼠血清中細胞因子IL-17、TNF-α、TGF-β表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-17、TNF-α、TGF-β表達顯著增高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，烏頭湯低/高劑量組、四妙散低/高劑量組、甲氨蝶呤組IL-17表達明顯降低（P<0.05或P<0.01）;烏頭湯高劑量組、四妙散低/高劑量組TNF-α的表達明顯降低（P<0.05或P<0.01）;各給藥組TGF-β表達差異無統計學意義（P>0.05）。與烏頭湯高劑量組比較，甲氨蝶呤組、烏頭湯低劑量組、四妙散低劑量組IL-17表達明顯升高（P<0.05或P<0.01）;烏頭湯低劑量組 TNF-α表達升高（P<0.05），其余給藥組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

4 討論

RA為自身免疫系統介導的關節滑膜慢性炎癥性反應，RA致病機制雖尚未完全闡明，但是已有大量研究表明，炎癥因子浸潤是RA疾病的主要特征表現之一。近年來，不少研究人員對炎癥因子和中醫病因病機進行歸納關聯研究，臨床中通過對RA患者進行不同證型與炎癥因子表達聯系的實驗中發現，風寒濕痹證組、濕熱痹證組和寒熱錯雜證組在IL-17和TNF-α等炎癥因子的表達含量明顯增高[9]。此外，動物實驗中發現風寒濕痹證AIA模型大鼠IL-17A水平比普通AIA模型大鼠升高明顯[10]。TNF-α、IL-17是驅動RA關節滑膜炎癥反應及關節破壞的關鍵炎癥細胞因子。TNF-α介導NF-κB通路活化，誘導VEGF、VCAM-1、IL-8等多種細胞因子生成，促進RA滑膜炎癥和血管翳的形成，TNF-α促進滑膜細胞內核因子κB受體活化因子配體表達，激活破骨細胞前體細胞，使其分化為成熟的破骨細胞，介導RA骨侵蝕[11-14]。“風寒濕”外邪通過JAK/STAT信號通路激活Th17細胞分化，產生IL-17，誘導破骨細胞分化，活化基質金屬蛋白酶MMPs，IL-17A不但誘導巨噬細胞產生IL-1β和TNF-α，又可誘導滑膜成纖維細胞分泌IL-6和IL-8，還可誘導RANKL表達[15-19]。一些調節性細胞因子（如TGF-β）和一些小分子蛋白酶類物質也共同參與RA的發生和發展。研究顯示，RA患者以及RA模型小鼠血清和滑膜組織中IL-10和TGF-β表達水平增高，推測可能是Breg細胞引起小鼠血清和滑膜組織中的IL-10和TGF-β的升高，通過產生IL-10、TGF-β等炎癥抑制因子，負向調控炎癥反應，并抑制關節疾病的進展[20-22]，說明RA患者可能更多處于病情活動期，其自身免疫處于活躍狀態。中醫理論則認為RA患者由于外感風寒、濕熱之邪蘊結于內，或嗜食肥甘厚膩，脾為濕困，郁而化熱，濕熱壅盛，與正邪交爭劇烈有關。

以甲氨蝶呤為基礎的多種抗風濕藥聯合、中西藥聯合治療是目前臨床主要治療手段[23]。《中藥新藥臨床研究指導原則》將RA分為濕熱痹阻、寒濕痹阻、痰瘀痹阻、瘀血阻絡、肝腎兩虛、氣陰兩虛6個證型[24]，而四妙散與烏頭湯分別是濕熱痹阻證、寒濕痹阻證的常用方，也是中醫“清熱祛濕”“散寒除濕”治法的代表方。

目前，關于RA的病證結合實驗動物模型研究文獻歸納起來有風寒濕痹證、風濕熱痹證、寒邪痹阻證、血瘀痹阻證、腎虛證及脾虛證RA大鼠模型，均是在大鼠RA模型成功后再聯合模擬外部刺激進行模型復刻[25]。這些大鼠關節炎病證模型仍存在部分爭議：（1）動物模型很難實現四診客觀化，如惡風、汗出、肢體沉重、脈象等都無法在動物身上得到觀察。（2）病證結合模型中是先建立“病”模型還是應該先建立“證”模型，亦或“病”“證”同時造模，這是一個爭論的焦點。（3）目前，病證結合造模思路是將西醫病理因素與中醫病因因素強行疊加一起，病、證之間缺乏關聯。在已有動物模型的基礎上，結合中醫類風濕關節炎特點，復制中醫病證結合模型方法及評價標準雖然目前還有難度，是今后RA動物模型重要的發展方向。

檢驗中醫動物模型最科學的方法是運用有拮抗或加強作用的方劑進行干預，根據癥狀及檢測指標來推測該模型的中醫證型屬性[26]。烏頭湯具有溫經散寒、通絡止痛的功效，是治療寒痹的經典方劑;四妙散具有清熱利濕、舒筋利痹的功效，是治療熱痹的經典方劑。膠原誘導的DBA/1小鼠RA模型是公認的成模率高、發病接近臨床的動物模型[27]，目前尚未見到有利用此模型進行病證結合RA研究的報道，本研究通過用烏頭湯、四妙散對DBA/1小鼠CIA模型進行干預，驗證DBA/1小鼠CIA模型的寒熱屬性，得出以下結論：烏頭湯或四妙散對實驗性CIA小鼠模型均有治療作用，對炎癥因子的抑制作用，可能是烏頭湯或四妙散起作用的機制之一，推測膠原誘導的DBA/1小鼠CIA模型的天然發病狀態，從中醫證候來說，既有寒證的屬性，也有熱證的屬性，要將此動物模型造成病證結合模型，有待進一步的深入研究。

參考文獻

[1] 王? 亮.類風濕關節炎免疫治療藥物的作用機制和應用進展[J].中國處方藥，2020，18（4）：25-26.

[2] 徐衛東，周? 琦，鄭? 光，等.利用文本挖掘技術分析治療類風濕關節炎中成藥和西藥使用基本規律[J].遼寧中醫雜志，2012，39（3）：425-427.

[3] 王? 建，鞏? 勛，唐曉頗，等.1602例類風濕關節炎患者中醫證候分布特點的多中心橫斷面調查[J].中醫雜志，2018，59（11）：963-967.

[4] 周? 儉，曾? 光，鮮瑤瑤.國醫大師熊繼柏辨治頑痹經驗舉隅[J].臨床醫學研究與實踐，2020，5（13）：133-134.

[5] 王康惠.四妙散加味治療類風濕關節炎的臨床療效觀察[J].中國醫藥科學，2018，8（21）：54-56.

[6] 蘭維婭，唐? 芳，馬武開，等.烏頭湯聯合常規西藥治療類風濕關節炎隨機對照試驗的Meta分析[J].風濕病與關節炎，2019，8（1）：36-40，45.

[7] 張玲玲，劉云潔，童? 彤，等.DBA/1小鼠膠原性關節炎模型建立方法及評價指標[J].中國藥理學通報，2010，26（8）：1108-1111.

[8] 周? 儉，曾? 光，鮮瑤瑤，等.熊果酸對CIA大鼠關節軟組織RANKL、RANK、OPG mRNA表達的影響[J].亞太傳統醫藥，2020，16（3）：28-30.

[9] 侯? 雷，元曉龍，曾? 蘋，等.類風濕關節炎中醫證型與IL-17及其相關炎癥因子表達的研究[J].中國民族民間醫藥，2019，28（3）：81-86.

[10] 張? 逢，戴宗順，林? 也，等.“風寒濕”外邪影響Th17/Treg失衡促進類風濕關節炎病證發生的分子機制研究[J].湖南中醫藥大學學報，2021，41（11）：1657-1662.

[11] 曾? 光，陳? 芳，邵? 峰，等.熊果酸對大鼠CIA模型關節TNF-α、IL-17、PGE2表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2018，38（1）：13-16.

[12] CALABRESI E， PETRELLI F， BONIFACIO A F， et al. One year in review 2018： Pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Clinical and Experimental Rheumatology， 2018， 36（2）： 175-184.

[13] SCHERER H U， H？魧UPL T， BURMESTER G R. The etiology of rheumatoid arthritis[J]. Journal of Autoimmunity， 2020， 110： 102400.

[14] KARAMI J， MASOUMI M， KHORRAMDELAZAD H， et al. Role of autophagy in the pathogenesis of rheumatoid arthritis： Latest evidence and therapeutic approaches[J]. Life Sciences， 2020， 254： 117734.

[15] 張? 婷.基于炎癥細胞因子表達譜的類風濕關節炎不同辨證分型臨床與基礎研究[D].長沙：湖南中醫藥大學，2021.

[16] BETTELLI E， CARRIER Y， GAO W， et al. Reciprocal develop？鄄

mental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J]. Nature， 2006， 441（7090）： 235-238.

[17] HONORATI M C， NERI S， CATTINI L， et al. Interleukin-17， a regulator of angiogenic factor release by synovial fibroblasts[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2006， 14（4）： 345-352.

[18] AWASTHI A， MURUGAIYAN G， KUCHROO V K. Interplay between effector Th17 and regulatory T cells[J]. Journal of Clinical Immunology， 2008， 28（6）： 660-670.

[19] ZHANG X， YUAN Y P， PAN Z P， et al. Elevated circulating IL-17 level is associated with inflammatory arthritis and disease activity： A meta-analysis[J]. Clinica Chimica Acta， 2019， 496： 76-83.

[20] ZHOU L， LOPES J E， CHONG M M W， et al. TGF-beta-induced Foxp3 inhibits T（H）17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function[J]. Nature， 2008， 453（7192）： 236-240.

[21] COOLES F A， ISAACS J D. Pathophysiology of rheumatoid arthritis[J]. Current Opinion in Rheumatology， 2011， 23（3）： 233-240.

[22] SUN W K， BAI Y， YI M M， et al. Expression of T follicular helper lymphocytes with different subsets and analysis of serum IL-6， IL-17， TGF-β and MMP-3 contents in patients with rheumatoid arthritis[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2019， 23（1）： 61-69.

[23] SMOLEN J S， ALETAHA D， BARTON A， et al. Rheumatoid arthritis[J]. Nature Reviews Disease Primers， 2018， 4： 18001.

[24] 黃? 晶，舒曉明，王? 貴，等.甲氨蝶呤治療類風濕關節炎的作用機制[J].中華臨床醫師雜志（電子版），2016，10（21）：3276-3280.

[25] 張新偉，阿熱艾·阿達力，豆江移，等.類風濕關節炎病證結合動物模型研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2021，30（34）：3868-3871.

[26] 林? 也，戴宗順，張? 婷，等.基于“以方測證”的類風濕關節炎風寒濕痹證動物模型的構建研究[J].湖南中醫藥大學學報，2021，41（5）：668-672.

[27] 李愛民，李曉娟，李瑞生.類風濕性關節炎大小鼠動物模型的研究進展[J].中國比較醫學雜志，2021，31（1）：151-156.