痰TB DNA檢測對非空洞性肺結核診斷的臨床價值

鄧勇　　彭云　　鄧崢　　歐書強　　曾桃　　李朝亮　　陶學萍

[摘要] 目的 了解痰TB DNA在非空洞性結核中的診斷價值。 方法 按照入院時間順序，收集江西省萍鄉市第二人民醫院感染科2019年1—12月住院診斷為非空洞性肺結核患者的臨床資料100例，主要包括肺部CT結果、痰抗酸染色、TB DNA，然后進行統計分析。 結果 TB DNA的陽性率為54%，痰抗酸染色的陽性率為27%，兩者相比差異有統計學意義（χ2=15.132，P<0.001），73例抗酸染色陰性患者中痰TB DNA陽性31例，TB DNA陰性42例。27例抗酸染色陽性患者中痰TB DNA陽性24例，TB DNA陰性3例。 結論 痰TB DNA檢測在非空洞性肺結核中的診斷價值高于痰抗酸染色，值得臨床推廣，但也有一定的假陰性率，必要時可多次送檢。

[關鍵詞] TB DNA;肺結核;非空洞型;痰

[中圖分類號] R521? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）08-0070-03

Clinical value of sputum TB DNA detection in diagnosis of non-cavitary pulmonary tuberculosis

DENG Yong PENG Yun DENG Zheng OU Shuqiang ZENG Tao LI Chaoliang TAO Xueping

Department of Infectious Diseases， Pingxiang No.2 People′s Hospital， Pingxiang? ?337000，China

[Abstract] Objective? To investigate the diagnostic value of sputum TB DNA in non-cavitary tuberculosis. Methods? Clinical data of 100 patients with non-cavitary tuberculosis diagnosed in Department of Infectious Diseases， Pingxiang No.2 People′s Hospital from January to December 2019 were collected， according to the time sequence of admission. The data mainly included lung CT results， sputum acid-fast staining， and TB DNA. Statistical analysis was conducted. Results? The positive rate of TB DNA was 54%， and that of sputum acid-fast staining was 27%， with statistically significant difference （χ2=15.132， P<0.001）. Among the 73 patients with negative acid-fast staining， 31 patients were positive for sputum TB DNA and 42 patients were negative for TB DNA. Among the 27 patients with positive acid-fast staining， 24 patients were positive for sputum TB DNA and 3 patients were negative for TB DNA. Conclusion? The diagnostic value of sputum TB DNA detection is higher than that of sputum acid-fast staining in non-cavitary tuberculosis. It is worthy of clinical promotion. However， it has certain false negative rate. Samples should be submitted for multiple inspections if necessary.

[Key words] TB DNA; Tuberculosis; Non-cavitary type; Sputum

結核病是一種慢性傳染病，數百年來一直威脅著公眾健康，目前每年仍然有多達1000 萬人罹患結核病[1]，尤其是在發展中國家，而我國結核的疫情大部分地區成下降趨勢[2]，但仍不容忽視，尤其是老年和受教育程度低者[3]。結核病的臨床診斷程序既費時又費力，傳統肺結核診斷依靠肺部影像學和痰抗酸染色進行診斷，在非空洞性的肺結核中，影像學相對更難鑒別，痰抗酸染色陽性率也更低，給臨床診治帶來諸多不便。而采用雙重實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術進行檢測痰中結核分枝桿菌的核酸，可以明顯提高檢測的陽性率。本文回顧性分析江西省萍鄉市第二人民醫院收治的100例非空洞性肺結核患者痰結核分枝桿菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和痰抗酸染色結果，對其臨床意義進行總結，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1—12月在萍鄉市第二人民醫院感染科住院臨床診斷為肺結核的病例，肺結核診斷標準參照國家衛建委發布的行業標準進行診斷[4]，根據入院時間先后順序、納入標準和排除標準進行病例收集，共收集100例符合要求的病例，并詳細記錄各研究對象的臨床資料（姓名、年齡、性別、發病情況、肺部影像學結果、痰抗酸染色結果等）。其中，男83例、女17例，年齡15～87歲，平均（56.7±17.7）歲。所有入組對象均知情同意，并簽署知情同意書。

納入標準：①所有入選對象均具有典型的肺結核的影像學表現或影像學不典型但抗結核治療有效證實為肺結核;②檢測晨痰抗酸染色至少1次者;③經過抗結核治療后1～3個月后肺部病灶吸收，且隨訪1年后肺部病灶穩定或纖維化;④順利規范隨訪1年者。

排除標準：①合并AIDS、乙型病毒性肝炎、腎功能不全、任何部位腫瘤者;②肺結核病灶影像學表現不典型者;③因出現藥物不良反應等原因未順利完成抗結核治療療程者;④隨訪過程中因患者死亡等任何因素導致失訪者。

1.2 方法

所有受檢者入院第2天清晨在漱口后咳出的深部痰分裝在兩個一次性帶蓋痰液杯子中，分別送檢痰抗酸染色和痰結核分枝桿菌核酸（pulmonary tuberculosis deoxyribonucleic acid，TB DNA），然后第2、3天用同樣的方法取得痰液標本進行送檢兩次痰抗酸染色。其中抗酸染色使用冷染法檢測，TB DNA采用熒光定量PCR檢測。

1.3 痰TB DNA檢測流程

1.3.1 DNA提取? 取出陰性質控品，8000 rmp離心數秒，吸50 μl至0.5 ml滅菌離心管中，加入50 μl DNA提取液中充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12 000 rmp離心5 min，備用。

1.3.2 標本處理? 向痰液玻璃管中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫放置15～30 min待液化;取液化后標本1.0 ml至1.5 ml離心管，12 000 rmp離心5 min。去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 ml混勻，12 000 rmp離心5 min，重復1次。去上清，沉淀加入50 μl DNA提取液中充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12 000 rmp離心5 min，備用。

1.3.3 PCR擴增? 按比例（TB-PCR反應液40 μl/人份+Tap酶3 μl/人份）取相應的PCR反應液及Taq酶，充分混勻后按43 μl/管分裝至0.2 ml離心管中，備用。向準備好試劑的0.2 ml試劑管中，分別加入處理后的樣品（包括標本、陰性質控品/臨界陽性質控品和強陽性質控品）上清液2 μl，或直接加入陽性定量參考品2 μl，8000 rpm離心數秒，放入儀器樣品槽。

1.3.4 編輯? 按對應順序設置陰性質控品、陽性定量參考品及未知標本，并在Name欄中設置樣品名稱，選中所有設置樣品孔，點擊工具欄中P鍵，選擇PRI primer l后關閉窗口。

1.3.5 結果分析? 在Analysis菜單下選擇Analyze自動分析結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰抗酸染色與TB DNA的陽性率比較

總共納入100例非空洞性肺結核，其中痰抗酸染色陽性27例，陽性率27.00%，其中只有6例為三次痰抗酸染色均陽性，其余均為多次痰抗酸染色中1～2次為陽性，TB DNA陽性54例，陽性率54.00%，兩者相比差異有統計學意義（χ2=15.132，P<0.001）。

2.2 痰抗酸染色陰性患者中TB DNA陽性情況

73例痰抗酸染色陰性患者中痰TB DNA陽性31例，TB DNA陰性42例。27例抗酸染色陽性患者中痰TB DNA陽性24例，TB DNA陰性3例。見表1。

2.3 TB DNA陽性患者中痰抗酸染色情況

54例TB DNA陽性的患者中TB DNA數值與抗酸染色陽性情況：TB DNA≤104拷貝的TB DNA陽性例數為22例，痰抗酸染色陽性例數為5例，抗酸染色陽性率9.26%，TB DNA在104到105拷貝之間TB DNA陽性例數為9例，痰抗酸染色陽性例數為3例，抗酸染色陽性率14.81%，TB DNA在105～106拷貝之間TB DNA陽性例數為9例，痰抗酸染色陽性例數為5例，抗酸染色陽性率24.07%，TB DNA>106拷貝的TB DNA陽性例數為14例，痰抗酸染色陽性例數為10例，抗酸染色陽性率42.59%。見表2。

2.4 不同年齡段TB DNA陽性情況

根據患者年齡情況分析，≤60歲患者中TB DNA陽性例數為30例，>60歲患者TB DNA陽性例數為24例，兩者TB DNA陽性率相比差異無統計學意義（χ2=0.015，P=0.904）。見表3。

3 討論

肺結核是呼吸系統常見的一種疾病，主要是因為感染結核分枝桿菌后引發，肺結核可引起咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、盜汗等臨床癥狀。但病灶不僅局限于肺部，也可以侵襲淋巴結、骨骼系統、神經系統等，侵犯神經系統可引起結核性腦膜炎，可導致患者頭痛、嘔吐、意識喪失等[5]。部分肺結核患者由于存在咳嗽的痰液未吐出，而是咽入胃部，在胃部未被消化液消化的結核桿菌可進入腸道引起腸結核。傳統肺結核診斷主要依賴于肺部影像學表現、臨床表現和抗酸染色。但實際上，肺結核的影像學表現并不會像教材中描述的那樣典型（表現為病變多發生在上葉的尖后段和下葉的背段，密度不均勻、邊緣較清楚和變化較慢，易形成空洞和播散病灶），而是出現多種表現，甚至表現為間質性肺炎的磨玻璃樣改變，臨床上不可避免地易導致誤診、誤治的情況發生[6-7]，即便是高分辨率CT在痰菌陰性的肺結核中診斷的陽性預測值僅約60%[8]，因此，肺結核的診斷不能依舊停留在影像學層面[9]。2015年，世界衛生組織批準了雄心勃勃的“消滅結核病”計劃，目標是到2035年將結核病發病率降低90%，結核病死亡率降低95%。為了結束全球結核病流行，必須改進診斷措施，提高肺結核確診率，并針對弱勢群體進行有效監測。

在病原學診斷方面，臨床上常采用痰抗酸染色和痰培養法，痰抗酸染色操作簡便、價格低廉，但受主觀因素影響等原因，其陽性率低，敏感性低，容易造成誤診、誤治。而痰培養周期長，雖然經過改良后現在的手段可以縮短周期，但目前還未能廣泛應用，無法滿足臨床需求，尤其是對于危重患者，如果等待培養結果再進行治療的話，則病情將無法得到控制，因此，往往僅適用于疾控中心對耐藥的監測及實驗室研究。本研究對江西省萍鄉市第二人民醫院臨床診斷為肺結核且影像學為非空洞性的肺結核患者進行3次痰抗酸染色和痰TB DNA檢測，發現3次送檢痰抗酸染色的累計陽性率僅為27.00%，而送檢1次的痰TB DNA的陽性率為54.00%，差異有統計學意義（P<0.05），提示痰TB DNA的陽性率明顯高于痰抗酸染色[10]，對于痰TB DNA陰性的患者進行多次送檢將進一步提高痰TB DNA的陽性率，且痰TB DNA檢測結果在數小時內就可出結果，有助于臨床的早期診斷。另外，可以對臨床懷疑存在耐藥的患者進行TB DNA的標本基因測序，根據耐藥基因序列從而檢測出是否存在耐藥。其中73例痰抗酸染色陰性患者中痰TB DNA陽性例數為31例，而在27例痰抗酸染色陽性患者中痰TB DNA陰性例數為3例，說明痰TB DNA也存在假陰性情況[11]，不排除與痰液送檢標本情況有關，因此，必要時也可考慮再次或多次送檢痰TB DNA檢測以提高陽性率。對54例TB DNA陽性的患者分析發現，31例痰TB DNA滴度<105 copies/ml的患者中痰抗酸染色陽性例數為8例，陽性率為25.80%，提示在低滴度TB DNA的痰液標本中絕大部分痰抗酸染色均為陰性，僅在高滴度TB DNA的痰液標本中才能顯示出陽性結果，痰抗酸染色陽性率低，尤其是在結核桿菌滴度低的情況下。根據年齡大小，以60歲為界限進行年齡分組進行組內分析發現，在>60歲組和≤60歲組中TB DNA陽性率無明顯差異，提示痰TB DNA陽性情況與年齡大小可能無相關性。但由于痰抗酸染色價格低廉，仍廣泛用于臨床，因此，在考慮經濟因素影響情況下（當然，實際上目前TB DNA價格也非常低），建議對痰抗酸染色陰性的患者，如果臨床考慮結核或普通抗生素治療效果欠佳又存在肺部病灶的患者，有必要行痰TB DNA檢測甚至多次檢測以提高結核病的診斷陽性率。

當然，PCR檢測TB DNA也存在部分缺點，如不能區分檢測標本中的擴增信號是來源于死菌還是活菌，對于已經抗結核治療后的肺結核，如果肺內仍存在已經死亡的結核桿菌，咳出的痰液標本經PCR檢測TB DNA仍可得出陽性結果，因此對病情的判斷尤其是已經使用了能夠殺死結核桿菌的抗菌藥物后，應結合臨床治療情況以及其他輔助檢查結果進行綜合判斷[12]。另外，部分肺結核患者不存在咳嗽、咳痰，可以通過支氣管鏡灌洗獲取肺泡灌洗液檢測TB DNA，目前本研究人員已在多例無咳嗽、咳痰且肺部病灶不典型的患者的肺泡灌洗液中檢測出TB DNA陽性，包括也有研究者發現在胸水等漿膜腔積液及患者的血液中檢測到TB DNA陽性[13-14]。

綜上所述，痰TB DNA的陽性率在非空洞性肺結核患者中的陽性率明顯高于痰抗酸染色，操作性方便，易于臨床開展，有助于臨床的早期診斷，值得臨床推廣。但也存在一定的假陰性情況，必要時可多次送檢，或者聯合其他檢測手段如肺泡灌洗液、X-Pert、TB RNA等有助于進一步提高陽性率[15-20]。

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（收稿日期：2021-03-15）