溶血標本對化學發光免疫分析法檢測HIV抗體檢驗結果的影響

張婷婷

[摘要] 目的? 研究血標本在應用化學發光免疫分析法檢測HIV抗體時對檢測結果的影響。方法 自我院體檢中心2020年1-12月間接受健康體檢的人群中選出100名志愿者，均采集外周靜脈血標本，將標本分成4份，1份為正常合格標本（未溶血組），將血液標本人工溶血成游離血紅蛋白<60 mmol/L（輕度溶血組）、（60～110） mmol/L（中度溶血組）、>110 mmol/L（重度溶血組），采用酶聯免疫吸附法和化學發光免疫分析法對四組標本進行HIV抗體檢測，對比吸光度A值和化學發光值（RLU）。結果 應用酶聯免疫吸附法檢測的血液標本，隨著溶血程度的提高，吸光度A值也明顯提高（P<0.05）;其中中度溶血組和重度溶血組的吸光度A值明顯高于未溶血組（P<0.05）;中度溶血組有2例假陽性，重度溶血組有6例假陽性。應用化學發光免疫分析法檢測的血液標本中：未溶血組的RLU值與輕度、中度、重度溶血組的RLU值比較，差異均無統計學意義（P>0.05），且輕度溶血組和中度溶血組均無假陽性，僅重度溶血組有1例假陽性。結論 在HIV抗體檢測中：溶血標本對應用酶聯免疫吸附法檢測的結果影響較大，對化學發光免疫分析法檢測的結果影響較小，但是隨著溶血程度的加重，應用化學發光免疫分析法檢測也可能出現假陽性，因此需加強檢驗前質量控制，保證標本的合格。

[關鍵詞] 溶血標本;HIV抗體;化學發光免疫分析法;酶聯免疫吸附法;假陽性

[中圖分類號] R446? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）08-0107-04

Effect of blood specimens on the detection results of HIV antibodies by chemiluminescent immunoassay

ZHANG Tingting

Clinical Laboratory Center， Affiliated Hospital of Liaoning University of Chinese Medicine， Shenyang? ?110032， China

[Abstract] Objective To study the effect of blood specimens on the detection results of HIV antibodies by chemiluminescent immunoassay （CLIA）. Methods A total of 100 volunteers were selected from the population undergoing health examination in our physical examination center from January 2020 to December 2020， and peripheral venous blood specimens were collected from these volunteers. The specimens were divided into four groups， which were respectively the normal qualified specimens （non-hemolyzed group）， free hemoglobin < 60 mmol/L （mildly hemolyzed group）， free hemoglobin in the range of 60～110 mmol/L （moderately hemolyzed group）， and free hemoglobin > 110 mmol/L （severely hemolyzed group） from the blood specimens that were artificially hemolyzed. The four groups of specimens were detected for HIV antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and CLIA， and the absorbance （A values） and chemiluminescence values （relative light unit， RLU） were compared between the four groups. Results The A values of the blood specimens detected by ELISA increased significantly with the increase of the degree of hemolysis （P<0.05）. The A values of the moderately hemolyzed group and the severely hemolyzed group were significantly higher than those of the non-hemolyzed group （P<0.05）. There were two pseudo positives in the moderately hemolyzed group and six pseudo positives in the severely hemolyzed group. In the blood specimens detected by CLIA， there were no statistically significant differences between the RLU values of the non-hemolyzed group and those of the mildly， moderately and severely hemolyzed groups （P>0.05）. In addition， there were no pseudo positives in the mildly and moderately hemolyzed groups， and there was only one pseudo positive case in the severely hemolyzed group. Conclusion In the detection of HIV antibodies， hemolyzed specimens have a greater impact on the results of ELISA and a smaller impact on the results of CLIA. However， as the degree of hemolysis increases， pseudo positives may also occur in CLIA. Therefore， it is necessary to strengthen pre-detection quality control to ensure that the specimens are qualified.

[Key words] Hemolyzed specimens; HIV antibodies; Chemiluminescent immunoassay; Enzyme-linked immunosorbent assay; Pseudo positive

艾滋病是常見的一種傳染性疾病，其經血液、性交、靜脈吸毒等途徑傳播，該病可破壞人體的免疫功能，導致反復感染，難以治愈[1-2]，艾滋病嚴重威脅著人們的生命健康[3]。在我國，艾滋病的疫情流行狀況大致是從高危人群向普通人群擴散，從局部向整體擴散。當前尚無治療HIV的特效藥物以及預防疫苗，因此加強對艾滋病的篩查，控制傳染源，切斷傳播途徑就顯得尤為重要[4-5]。檢測血清中的HIV抗體是臨床上診斷艾滋病的主要依據，而不同的檢測方法的結果可能存在一定差異，酶聯免疫吸附法和化學發光免疫分析法是目前最常用的兩種方法，其中化學發光免疫分析法具有自動化程度、靈敏度和特異度高的特點[6]，正在逐漸取代酶聯免疫吸附法。但在實驗室檢驗工作中發現，溶血會對多種檢測結果產生一定影響。本文特探討溶血對HIV檢測結果的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

自我院體檢中心2020年1-12月接受健康體檢的人群中選出100名志愿者，納入標準[7]：（1）未感染HIV病毒。（2）年齡18～89歲，性別不限。（3）自愿參與本研究，簽署知情同意書。排出標準[8]：（1）合并先天性疾病、重要臟器功能障礙、免疫系統疾病等患者。（2）合并其他傳染疾病者。（3）合并認知交流障礙、精神疾病者。（4）臨床資料不完整者。本組100例志愿者中：男47例，女53例，年齡23～78歲，平均（42.9±11.3）歲;BMI指數為（17.3～25.6） kg/m2，平均（21.9±1.0）kg/m2。100例志愿者均在相同條件下采集4份標本，將標本分成未溶血組、輕度溶血組、中度溶血組和重度溶血組，四組標本的一般資料差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）ELISA法檢測應用的儀器與試劑為BIO-RAD 680酶標儀、MINDRAY MW-12A洗板機，同時由萬泰生物藥業股份有限公司提供配套的ELISA法HIV抗體診斷試劑盒。化學發光免疫分析法應用的儀器與試劑為LIAISON XL發光儀及配套試劑（由SORIN公司提供）。（2）具體方法：100名志愿者均采集肘正中靜脈血10 ml到離心管中，分成4份，1份為肉眼無可見的溶血、脂血、黃疸的正常合格標本，設為未溶血組（n=100），待血液凝固后，將凝固后的血液標本置于離心機上以4000 r/min的速度離心10 min左右，然后取上層血清。其余3份標本則采用物理振蕩和反復凍融的物理方法進行人工溶血，然后分離血清，采用鄰里氨甲苯胺法測定游離血紅蛋白，確定標本的溶血程度，分別為游離血紅蛋白<60 mmol/L（輕度溶血組，n=100）、（60～110） mmol/L（中度溶血組，n=100）、>110 mmol/L（重度溶血組，n=100）。對4組血液標本進行HIV抗體檢測，分別采用酶聯免疫吸附法和化學發光免疫分析法檢測，按照儀器的操作說明手冊、配套試劑的使用說明書等規范檢測，為保證檢測結果的可比性，檢測時保證在一個實驗室內完成，檢測的試劑采用同一批次。

1.3 觀察指標

對比同一標本在溶血前后的吸光度A值和化學發光值（RLU），其中化學發光免疫分析法檢測的判斷標準是：當化學發光值≥臨界值（CO）時判定為陽性;ELISA法的判斷標準：吸光度A值≥臨界值時判定為陽性[9]。初篩為陽性者需重新采集標本復檢，若仍為陽性，則需送疾控中心用免疫印跡法認證。

1.4 統計學方法

使用SPSS24.0軟件檢驗數據資料，計量資料比較采用t檢驗， P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組標本的檢測結果

見表1所示，采用酶聯免疫吸附法檢測的標本，隨著溶血程度的提高，吸光度A值也明顯提高（P<0.05）;其中中度溶血組與重度溶血組的吸光度A值明顯高于未溶血組（P<0.05）。在化學發光免疫分析法檢測中：未溶血組與不同程度溶血組的RLU值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 四組的陽性率比較

見表2所示，應用酶聯免疫吸附法檢測的標本，其中中度溶血組有2例假陽性，重度溶血組有6例假陽性;而化學發光免疫分析法檢測僅重度溶血組有1例假陽性。

3 討論

3.1 艾滋病的流行特點概述

艾滋病（AIDS）是危及人類生命健康的一類傳染疾病，是目前在全球內流行的一種傳染病。近40年來，全球每年因艾滋病致死的人數就在2500萬以上。在我國，1985年首例艾滋病病例被報道，此后艾滋病病例逐漸增多。據流行病學調查顯示：近年來我國的艾滋病發病率呈上升趨勢，在地域分布上呈西高東低、南高北低的趨勢，部分地區高低波動，西南地區、新疆是艾滋病的高發地區。目前臨床上尚無特效藥物治療，而且在性解放、人口流動大、毒品交易、同性戀等泛濫的社會環境中，HIV感染疫情嚴重。由于艾滋病的潛伏期長，初期HIV感染者無明顯癥狀，不易被發現，繼而可通過血液、性交等方式傳播給他人，造成艾滋病的泛濫。因此，加強對普通人群的HIV抗體檢測，及時篩查出HIV感染或AIDS患者，對于控制傳染源、切斷傳播途徑具有重要意義。

3.2 HIV抗體檢測的兩種方法

而HIV感染的診斷鑒別是嚴謹的臨床工作，其診斷結果需要高度精確。目前以HIV抗體檢測為主，不同的檢測方法、檢測試劑等均可能導致檢測結果的不準確，造成假陽性。（1）酶聯免疫吸附法（ELISA）是檢測HIV抗體的常用方法之一，但是其操作流程相對繁瑣，一般需1～2 h才能出檢測結果，耗時長。操作過程中的反復加氧和洗板等操作增加了結果的誤差[10-11]，對于HIV濃度低的標本，應用該法檢測的靈敏度偏低，易出現假陰性。尤其是溶血標本對ELISA檢測結果的影響較大，這主要是因為游離血紅蛋白具有過氧化物酶活性，其與辣根過氧化物酶作用相似，在ELISA檢測中可催化底物顯色，導致假陽性結果。（2）化學發光免疫分析法于20世紀90年代被引入到HIV抗體檢測中，該方法是將化學發光或生物發光體系與免疫反應結合起來的一種技術，被用于檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫測定技術，其工作原理與放射免疫、酶免疫相似，但是也有其獨特的特點，化學發光免疫分析法是借助發光底物自身的發光強度來直接測定，測得的光量子數和待測樣本中的抗原/抗體濃度成正比，因此該方法可用于定性、定量、半定量測定中[12]。在檢測的工作原理上與ELISA不同，其不受游離血紅蛋白中類過氧化物酶活性的影響，不會產生顏色反應影響檢測結果。化學發光免疫分析法是一種異相免疫分析方法，抗原抗體能高效結合，靈敏度可達（10～22）mol/L，線性范圍較寬，其發光強度在4～6個量級，與待測物質濃度呈線性關系。且分析方法簡單，大多數情況下僅需加入一種試劑或復合試劑就能完成全自動化的操作。操作過程中無需任何光源照射，避免了光源穩定性、光散射等因素的干擾，結果較為穩定，誤差小。除此之外，化學發光免疫分析法的耗時短，能隨時檢測，適用于急診快速檢驗中。

3.3 溶血標本對ELISA法檢測HIV抗體結果的影響

溶血標本會對多種檢測項目的結果產生一定影響，可能導致假陽性、假陰性等結果，影響臨床診療。本次研究中分析溶血標本對HIV抗體檢測結果的影響，結果顯示：對采用ELISA檢測的標本，隨著血液標本的溶血程度加重，吸光度A值也逐漸提高，且假陽性率也逐漸提高（P<0.05）;其中中度溶血組的假陽性率為2.0%，重度溶血組的假陽性率為6.0%，說明對于采用ELISA法檢測HIV抗體時，標本的溶血會對檢測結果產生明顯影響，極易出現假陽性結果，影響臨床診療。出現這一結果的原因可能是：（1）ELISA檢測中，由于溶血后的血液標本中游離血紅蛋白增加，在溫育操作中，血液中游離的血紅蛋白會被吸附到反應孔中。血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類似于過氧化物酶的作用，能在氧化劑的作用下催化顯色，因此溶血標本檢測時游離血紅蛋白可能會與加入的化學發光底物液發生一定的反應，出現異常顯色結果，導致假陽性，或是檢測結果偏高[13]。（2）血紅素的紅色會干擾比色分析，一般可通過標本空白部分來消除比色分析中的干擾，但是由于檢測中增加光的吸收，故而在波長相近的比色試驗中依然會產生一定的干擾性，影響檢測結果的準確性。因此ELISA檢驗中受到標本溶血的影響較大。

3.4 溶血標本對化學發光免疫分析法檢測HIV抗體結果的影響

對于采用化學發光免疫分析法檢測的標本，未溶血組與輕度溶血組、中度溶血組、重度溶血組的RLU值對比差異均無統計學意義（P>0.05），且僅重度溶血組有1例假陽性，假陽性率為1.0%，提示我們化學發光免疫分析法檢測HIV抗體時，標本的溶血對檢驗結果的影響不大，主要是因為：化學發光免疫分析法的特異度高，一般不會受到各種因素的影響，假陽性率低。檢測一般在封閉的流動系統中進行，從而避免了交叉感染的發生，也保障了試劑的穩定性，保證了檢測結果的穩定性和準確性。在HIV抗體檢測中應用化學發光免疫分析法耗時短，一般可在20 min內完成檢測，大大縮短初篩報告的出具時間，其檢測耗時明顯短于ELISA法。另外，化學發光免疫分析法的檢測靈敏度、特異度也高于ELISA法，因此具有更明顯的優勢[14-15]。

在實驗室的檢驗工作中，血液標本極易發生溶血現象，如血標本送檢延遲、血標本采集操作不當等均可能導致溶血現象。而對于溶血標本，檢驗科需盡快與送檢科室聯系，并分析溶血的原因，結合檢驗項目以及臨床實際。若檢測項目受溶血的影響較大，需及時通知相關醫護人員和受檢人員重新采集血標本，以保證檢測結果的準確性。另外還需加強對血標本采集人員的培訓教育，提高采集人員的業務能力，盡可能減少溶血標本。

綜上所述，溶血標本在ELISA檢測HIV抗體時影響較大，易出現假陽性結果;對采用化學發光免疫分析法檢測HIV抗體時影響不大。化學發光免疫分析法具有耗時短、靈敏度和特異度高、線性范圍廣、自動化程度高等優點，值得在HIV抗體檢測中應用，同時還應加強對溶血標本的管理，避免溶血對檢測結果造成的不良影響，保證檢測結果的準確性。

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（收稿日期：2021-02-18）