菏澤市新生兒原發性肉堿缺乏癥串聯質譜篩查分析

汪玉鋒

[摘要] 目的 了解原發性肉堿缺乏癥（PCD）在菏澤市新生兒中的發病率，并對基因突變特點、治療及預后進行分析。方法 利用串聯質譜技術對2016年1月至2020年12月258 682例新生兒進行血酰基肉堿譜檢測，對初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L伴有多個酰基肉堿下降的新生兒及母親進行串聯質譜、二代測序基因檢測。結果 共確診游離肉堿缺乏癥21例，其中9例原發性肉堿缺乏癥，11例母源性肉堿缺乏癥，1例父源性肉堿缺乏癥。8例進行基因檢測，其中7例檢測到2個等位基因（孩子5例、母親1例、父親1例）、雜合1例。SLC22A5基因共發現10種基因突變位點：c.1400C>G、c.51C>G、c.95A>G、c.865C>T、c.680G>A、c.761G>A、c.760C>T、c.952-21C>G、c.572A>G、c.1229G>A。其中c.952-21C>G、c.572A>G以及c.1229G>A，均為新發突變位點。結論 利用串聯質譜技術篩查結合二代測序技術可早期檢出原發性或母源性肉堿缺乏癥。經左卡尼汀治療的患兒預后良好，可有效預防猝死。菏澤市新生兒原發性肉堿缺乏癥患病率約為1/28 743，與國內已報道的發病率接近。基因檢測發現10種SLC22A5基因突變位點，其中c.1400C>G位點在菏澤市出現頻率較高，3個新發突變位點，新突變的位點豐富了SLC22A5基因的突變圖譜。

[關鍵詞] 原發性肉堿缺乏癥;串聯質譜;SLC22A5基因;新生兒

[中圖分類號] R722.11;R363.25? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）07-0154-04

Screening analysis of neonatal primary carnitine deficiency by tandem mass spectrometry in Heze

WANG Yufeng

Neonatal Disease Screening Center，Heze Maternal and Child Health and Family Planning Service Center， Heze 274000， China

[Abstract] Objective To investigate the incidence of primary carnitine deficiency（PCD） in newborns in Heze， and to analyze the characteristics， treatment and prognosis of gene mutation. Methods The blood acylcarnitine carnitine profiles of 258 682 neonates from January 2016 to December 2020 were detected by tandem mass spectrometry， and the primary screened neonates and mothers with free carnitine （C0） less than 9 umol/L and multiple acyl carnitine decreases were subjected to tandem mass spectrometry and second-generation sequencing gene detection. Results A total of 21 cases of free carnitine deficiency were diagnosed， including 9 cases of primary carnitine deficiency， 11 cases of maternal carnitine deficiency and 1 case of paternal carnitine deficiency. Gene detection was performed in 8 cases， of which 2 alleles （5 children， 1 mother， 1 father） and 1 heterozygosity were detected in 7 cases. Ten mutation sites of SLC22A5 gene were found： c.1400C > G， c.51C > G， c.95A > G， c.865C > T， c.680G > A， c.761G > A， c.760C > T， c.952-21C > G， c.572A > G， c.1229G > A. Among them， c. 952-21C > G， c. 572A > G and c. 1229G > A were all new mutation sites. Conclusion The screening by tandem mass spectrometry combined with second-generation sequencing can detect primary or maternal carnitine deficiency in the early stage. Children treated with levocarnitine have a good prognosis， which can effectively prevent sudden death. The prevalence rate of PCD in newborns in Heze is about 1/28743， which is close to the incidence reported in China. Ten kinds of mutation sites of SLC22A5 gene were found by gene detection， among which c. 1400C > G site appeared more frequently in Heze， and there were 3 new mutation sites. The new mutation sites enriched the mutation map of SLC22A5 gene.

[Key words] Primary carnitine deficiency; Tandem mass spectrometry; SLC22A5 gene; Newborn

原發性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency，PCD）是由于細胞膜肉堿轉運蛋白的編碼基因SLC22A5突變致脂肪酸β氧化障礙而引發的遺傳方式為常染色體隱性遺傳的疾病[1]。PCD患者細胞這一功能缺陷，細胞內肉堿濃度隨細胞外降低而下降，長鏈脂肪酸不能通過線粒體膜進行脂肪酸β氧化，從而引起心肌、肝臟、骨骼及神經系統等臟器功能受損[2]。本研究利用串聯質譜技術對258 682例新生兒酰基肉堿譜篩查，對初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L通知家屬在當地采血機構重采末梢血進行串聯復查，復篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L伴或不伴多個酰基肉堿下降，立即召回進一步做相關檢查，聯合二代測序技術共確診21例游離肉堿缺乏癥，菏澤市PCD發病率為1/28 743，基因發現了10種SLC22A5突變位點，以c.1400 C>G位點攜帶率最高，其中3種未報道。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2016年1月至2020年12月在菏澤市各縣區所設有產科的醫療機構出生的258 682例活產新生兒為研究對象，進行酰基肉堿譜篩查前經家長同意自費，簽署知情同意書。

1.2 標本采集和遞送

按照《新生兒疾病篩查血片采集技術規范》要求，出生72 h后經充分哺乳（6次以上）或7 d以內，用一次性采血針穿刺其足跟內或外側采集足跟血，并滴于新生兒篩查專用濾紙，使血片自然滲透至濾紙背面，采集3個直徑>8.0 mm的血斑。采集后的血斑水平懸掛，室溫下自然晾干，密封保存，放于2.0～8.0℃冰箱保存。專人到各采血機構收集標本，并以全程冷鏈的形式運送至山東省菏澤市婦幼保健計劃生育服務中心新生兒疾病篩查中心實驗室檢測。

1.3 方法

1.3.1檢測儀器? AB SCIEX API3200串聯質譜儀，SHIMADIU LC-20AD液相泵。

1.3.2檢測試劑? 非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測試試劑盒，HPLC級純度的甲醇。

1.3.3檢測方法? 收集的樣本血斑經打孔器取直徑3 mm圓形濾紙片，放置于96孔U型底微孔板中，每孔加入工作溶液100 μl，覆蓋微孔板。快速將微孔板放置在振蕩器上，在溫度為30℃（±5℃），振頻為650～750 r/min的條件下震蕩孵育45 min。轉移至V型底微孔板中、蓋板、上機檢測。

1.3.4 SLC22A5基因檢測分析? 對游離肉堿初篩陽性伴多個酰基肉堿降低標本立即召回采血復查，同時對新生兒及母親進行串聯質譜檢查，以便排除母源性肉堿缺乏，結合基因檢測進行診斷。經受試者家長知情同意后，受試者和父母同時采集2 ml（EDTA抗凝）遞送三方實驗室（杭州甄元醫學檢驗實驗室）進行遺傳代謝病panelDNA質譜基因分析，并對有致病基因位點的新生兒父母進行Sanger測序驗證。

2 結果

2.1 新生兒遺傳代謝病篩查確診情況

2016年1月至2020年12月菏澤市對258 682例新生兒進行酰基肉堿譜篩查，可疑陽性人數156例，召回151例;對初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L通知家屬在當地采血機構重采末梢血進行串聯復查，復篩游離肉堿（C0）仍低于9 μmol/L伴或不伴多個酰基肉堿下降，建議新生兒及母親進行串聯質譜檢查，以便排除母源性肉堿缺乏，對高度可疑者進一步聯合二代測序行遺傳代謝病panelDNA質譜基因分析，共確診游離肉堿缺乏癥患者21例;其中9例原發性肉堿缺乏癥，患病率為1/28 743，11例母源性肉堿缺乏癥，1例為父源性患者。見表1。

2.2 診斷治療和隨訪

PCD是一種避免感染、饑餓及高強度運動的治療，需用補充左旋肉堿治療，使血漿游離肉堿水平控制在參考范圍的中低水平[3]。原發性肉堿缺乏癥確診9例（男6例，女3例），2例未治療，7例給予左卡尼汀100～200 mg/（kg·d）， 分3次口服，1個月后復查串聯質譜，隨著年齡增長及肉堿水平穩定，逐漸延長復診時間;定期檢測串聯質譜、血糖、肝功能、腎功能、心肌酶譜等生化指標，生長發育評估等，及時調整藥物劑量;治療中的患者末次隨訪年齡為0.2～5.4歲，治療前C0 5.68（3.60～7.85）μmol/L，治療后C0 16.29（12.73～22.98）μmol/L，使游離肉堿水平控制在參考范圍的中低水平，具體控制情況及臨床表現見表1。母源性游離肉堿缺乏11例，初篩游離肉堿C0 2.74（0.92～6.55）μmol/L，均未治療，未進一步做心臟超聲及肝腎功能、心肌酶譜、血糖等相關生化檢查，電話隨訪，1例孕期伴有反復低血糖、常有疲倦感或心前區不適，其他均無明顯異常臨床表現。初篩陽性高度可疑PCD約17例，初篩游離肉堿C0 4.74（2.30～7.86）μmol/L，復篩游離肉堿C0 6.70（2.94～10.28）μmol/L，未做進一步做相關檢查，未分出原發性或繼發性游離肉堿缺乏癥，電話隨訪，均未出現任何臨床表現。

2.3 基因突變分析結果

21例肉堿缺乏癥患者中，8例進行遺傳代謝病panelDNA質譜基因分析，5例患兒、1例母源性、1位父親均檢測到2個等位基因，1例患兒為雜合攜帶;除母源性PCD和父親PCD患者基因未做Sanger測序驗證;其他5例患兒均行Sanger測序驗證基因變異來源，分別來自父母，共發現10種SLC22A5基因突變位點，3種新發突變未報道。見表2、圖1。

3 討論

在我國脂肪酸氧化障礙最常見的為PCD，隨著越來越多地區開展串聯質譜技術應用于篩查中，提高了PCD的檢出率;人體內肉堿合成主要來源于外源性食物攝入，約占體內總量的75%，其余25%由肝臟和腎臟合成[4]。若母體體內游離肉堿充足，則新生兒生后短期內仍會保持充足的儲備，這樣會導致新生兒篩查出現假陰性;孕期母親若為長期素食或孕吐嚴重不能正常進食者，早產兒、低體重、營養不良等因素使新生兒篩查結果會出現假陽性。所以檢測新生兒及其母親體內肉堿含量判斷原因的主要出處[5]。本中心對初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L通知家屬在當地采血機構重采末梢血進行串聯復查，復篩游離肉堿（CO）低于9 μmol/L伴或不伴多個酰基肉堿下降，建議新生兒及母親進行串聯質譜檢查，以便排除母源性肉堿缺乏。

不同的國家和地區發病率相差較大，澳大利亞的發病率較低，約為 1/120 000[6]。我國尚無全國性患病率的統計數據，上海市統計發病率約為1/45 000[7]，浙江省約為1/22 384[8]，石家莊市發病率約為1/17 785[9]。此研究共確診9例原發性肉堿缺乏癥患兒，患病率為1/28 743，患病率介于兩地之間，我國患病率遠高于國外，可能與種族和地域有關。

PCD屬常染色體隱性遺傳病，致病基因SLC22A5定位于染色體5q31.1，包括 10 個外顯子和 9 個內含子，其編碼的肉堿轉運蛋白由557個氨基酸組成，包含 12 個跨區和一個ATP 結合區[10]。有研究表明，SLC22A5 基因突變有180余種，多為錯義突變，無義突變以及移碼突變，剪接位點的突變較少，發生突變最為頻繁的是1號外顯子[11]。 很多研究人員認為，國內的突變主要是c.760C>T和c.1400C>G[12]。本文對8例患者行二代測序行遺傳代謝病panelDNA質譜基因分析，共檢測出7例攜帶2個等位基因，1例為雜合變異，共檢出10種SLC22A5基因突變位點其中5例攜帶c.1400C>G，約占71.4%。1例攜帶c.760C>T，約占10%，和國內發現的熱點突變相比較，菏澤市熱點突變以c.1400C>G為主。檢測到新發突變位點c.952-21C>G、c.572A>G、c.1229G>A未見文獻報道，豐富了SLC22A5基因庫，為產前診斷提供更好的依據。

綜上所述，PCD的主要臨床表現為擴張型心肌病、肝腫大、肌無力等，部分PCD患者終生無任何異常臨床表現，有些患者如果不及時醫治可能會導致死亡，因此最有效的治療方法是早期的診斷[13-14]。由于臨床表現有較強的異質性、臨床癥狀不典型，容易漏診或誤診，依靠串聯質譜技術檢測血中游離肉堿的含量對PCD檢出率明顯增高，確診還需結合SLC22A5基因突變分析;并且通過新生兒篩查能檢出較多母親源性PCD甚至父源性PCD。對于PCD患者需根據監測串聯質譜游離肉堿水平進行個體化治療[15]。飲食方面避免長期饑餓，多食瘦肉，病情穩定期給予左卡尼汀100～200 mg/（kg·d）， 分3次口服;患者若出現感染、大型手術或出現能量代謝危象時，建議及時靜脈輸注葡萄糖，使血糖控制在正常范圍，聯合口服或靜脈給予左卡尼汀劑量加大1倍，以免出現各臟器的損傷或猝死。經左卡尼汀治療的絕大多數患兒未見明顯異常臨床表現，也有部分患者依從性較差，擅自停藥治療，可誘發反復低血糖、甚至能量代謝危象及猝死的嚴重后果[16-17]。多數患者通過左卡尼汀藥物口服及對癥治療，預后良好，少數患者未治療，時有易疲倦或心前區有不適。目前認為PCD患者需要終生和規律使用左卡尼汀治療，避免病情發作[18]。菏澤市PCD檢出率為1/28 743，基因檢測菏澤市熱點突變以c.1400C>G為主，與國內已報道相近，另外本中心大概將近10例新生兒干血片檢查結果高度可疑游離肉堿缺乏癥，因家屬意識不到遺傳代謝病的危害性，未進一步做相關檢查，對新生兒遺傳代謝病應加大宣傳（教）力度，提高群眾對遺傳代謝病的認識，同時針對患兒家長加強健康宣教，能夠保證遵醫囑治療，正規隨訪，PCD患兒的良好預后才能得到保證。致病基因SLC22A5位點不僅可以作為確診的依據，還可作為產前診斷的依據[19]。再次妊娠應在孕婦妊娠12或18周以前取胎兒絨毛或羊水檢測基因位點，通過預測診斷決定是否為患兒，并提高存活率[20]。

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