MicroRNA-183對急性主動脈夾層細胞外基質重塑的作用及其機制研究*

韋耀東，袁敏，魏夢瑤，劉岳恒，于洋，蔣璇，趙曄，師恩祎，谷天祥

（中國醫科大學附屬第一醫院心臟外科，遼寧沈陽 110000）

急性主動脈夾層（acute aortic dissection, AAD）是一種急性心血管疾病，發病機制與主動脈中膜細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的降解有關。有研究報道， 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）通過調節ECM 重塑，參與胸主動脈瘤或胸主動脈夾層的發病，其中MMP-9作為MMPs 家族的一員，具有很強的降解彈性蛋白和膠原蛋白的能力，可導致主動脈中層的彈性蛋白和膠原蛋白大量崩解，誘導平滑肌細胞凋亡，從而促進主動脈夾層的形成[1-2]。 MicroRNA（miRNAs）的異常表達與多種心血管疾病的發展、發展有關[3]，引起人們廣泛關注。在腫瘤中，細胞的增殖、侵襲、轉移與MMP-9 在ECM 重塑和蛋白水解中的作用密不可分[4]，而miR-183 能夠通過靶向調控MMP-9 的表達，抑制細胞的增殖、侵襲、轉移[5-6]。目前miR-183 在AAD 中的表達及作用機制尚不清楚，本研究旨在探討miR-183 和MMP-9在AAD 中的表達及其作用機制，以及其參與調節平滑肌細胞ECM 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月—2018年8月在中國醫科大學附屬第一醫院就診的AAD 患者。納入標準：①經影像學診斷為AAD；②簽字接受主動脈手術治療的患者；③臨床資料完整。排除標準：①馬方綜合征；②大動脈炎；③梅毒性主動脈夾層；④主動脈粥樣硬化。根據納入和排除標準，共納入20 例AAD 患者作為AAD 組，其中男性14 例，女性6 例；年齡32～69 歲，平均（52.2±10.6）歲；選取20 例同期本院無主動脈病變的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者為NC 組，其中男性12 例，女性8 例；年齡33～65 歲，平均（54.8±9.0）歲。AAD 組標本取自升主動脈段破口周圍的組織，NC 組標本取自在升主動脈處打孔的廢棄組織，組織離體后，立即置于液氮中速凍，置入-80℃冰箱冷凍保存備檢。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（No：AF-SOP-07-1.1-01）。

1.2 主要試劑與儀器

人主動脈平滑肌細胞（HASMC）（美國ATCC 公司），引物、miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor 及RNAifectin?Transfection Reagent（加拿大ABM 公司），RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗人MMP-9、Elastin 抗體（英國Abcom 公司）。ABI 7500 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國ABI 公司）。

1.3 HASMC細胞培養與轉染

將細胞快速解凍復蘇，培養于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基中，置于37%、5%二氧化碳培養箱中。取增殖狀態良好的細胞進行消化、離心、計數，按1×105個/孔的密度種植于6 孔板中，待細胞融合達70%～80%，按照RNAifectin?Transfection Reagent 說明書實驗步驟用miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor 對HASMC 進行轉染，分別作為Mimic 組、Inhibitor 組，同時設置空白作為對照組，每組至少3孔。轉染后置于培養箱內6 h，更換培養基后繼續培養48 h，收集細胞用于下一步實驗。

1.4 qRT-PCR 檢測miRNA-183、MMP-9 mRNA的表達

采用TRIzol 法提取組織及細胞中總RNA，檢測RNA 濃度及純度，按照說明書進行逆轉錄，按比例加入Master Mix、正反向引物、RNAase-free 水，共20 μL，在qRT-PCR 儀上反應，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s、60℃退火34 s，共40 個循環，采用2-ΔΔCt法計算組織miRNA-183 相對表達量，以及細胞miRNA-183、MMP-9 mRNA 相對表達量。引物序列由加拿大ABM 公司提供，具體序列未告知。

1.5 Western blotting檢測MMP-9、Elastin蛋白的表達

使用RIPA 裂解液提取組織和細胞中總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，配制SDS-PAGE 凝膠，每個孔道加入等量蛋白，電泳分離，標準濕式轉膜，用PVDF 膜封閉于含5%脫脂牛奶中，水平搖床上室溫封閉1.5～2.0 h，一抗4℃孵育過夜（MMP-9 稀釋比例1∶3 000，Elastin 稀釋比例1∶300），二抗室溫孵育2 h，使用ECL 發光液在暗室中發光顯色。Image J 分析條帶灰度值，以GAPDH 為內參，以各目的蛋白與內參蛋白的比值作為組織中MMP-9 蛋白，以及細胞中MMP-9、Elastin 蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

AAD 組與NC 組年齡、性別構成比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較 （n=20）

2.2 兩組miRNA-183、MMP-9 蛋白相對表達量比較

兩組miRNA-183、MMP-9 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），AAD組miRNA-183 相對表達量低于NC 組，而MMP-9 蛋白相對表達量高于NC 組。見表2和圖1。

表2 兩組miRNA-183、MMP-9蛋白相對表達量比較（n=20，±s）

表2 兩組miRNA-183、MMP-9蛋白相對表達量比較（n=20，±s）

組別AAD組NC組t 值P 值miRNA-183 0.55±0.21 1.01±0.15-5.668 0.000 MMP-9蛋白0.97±0.04 0.64±0.13 4.728 0.013

圖1 各組MMP-9蛋白的表達

2.3 轉染后各組miRNA-183、MMP-9 mRNA 和蛋白、Elastin相對表達量比較

對細胞進行轉染后，Mimic 組、Inhibitor 組、對照組miRNA-183、MMP-9 mRNA 和蛋白、Elastin 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，Mimic組miRNA-183、Elastin 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），MMP-9 mRNA 和蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；Inhibitor 組miRNA-183、Elastin 相對表達量降低（P＜0.05），MMP-9 mRNA 和蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 轉染后各組miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相對表達量比較 （±s）

表3 轉染后各組miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相對表達量比較 （±s）

組別miRNA-183 Elastin蛋白Mimic組Inhibitor組對照組F 值P 值1.59±0.19 0.82±0.15 1.01±0.07 33.649 0.000 MMP-9 mRNA 0.62±0.15 1.53±0.17 1.01±0.13 49.109 0.000 MMP-9蛋白0.32±0.03 1.19±0.1 0.69±0.02 139.958 0.000 1.22±0.11 0.31±0.06 0.79±0.04 110.194 0.000

圖2 過表達或抑制miR-183對MMP-9、Elastin蛋白表達的影響

3 討論

AAD 是一種嚴重威脅人類生命的心血管疾病，病情危急兇險，發病急驟、進展迅速、病死率高，每年發病率為4/10 萬～7/10 萬，且逐年上升[7-8]。據文獻報道，未經治療的Stanford A 型AAD 患者發病早期的病死率高達l%～2%/h，48 h 內的病死率約為50%[9]。近20年來，隨著影像學診斷技術、外科治療技術和血管內治療技術的進步，A 型AAD 患者的總病死率有所下降，且A 型和B 型AAD 患者的手術病死率顯著下降[10]。目前對AAD 的早期診斷、鑒別診斷、風險分層及預后評估都有其局限性。因此，積極探索AAD 的發病機制，對預測高發人群，尋找干預治療靶點具有重要價值。

散發性AAD 的病理特征包括ECM 的改變和平滑肌細胞的丟失[11-12]，其中ECM 的改變主要是膠原蛋白和彈性蛋白大量降解及表達下調[13]。MMPs 是一種鋅依賴性內源性蛋白酶家族，在ECM 成分蛋白的重塑和降解中發揮多種作用。大多數蛋白水解酶無法降解膠原蛋白和彈性蛋白，而MMPs 對膠原蛋白和彈性蛋白具有極強的降解能力[14]。MMP-9 是一種Ⅳ型膠原蛋白酶，能夠降解多種膠原蛋白，對彈性蛋白同樣具有很強的降解能力[15]。有研究表明，在胸主動脈夾層患者的主動脈壁中，MMP-9 蛋白主要定位于組織病變嚴重的區域[16]，這與其降解膠原蛋白和彈性蛋白的能力有關。本研究結果表明，MMP-9 蛋白明顯高表達，且體外實驗中，Elastin 隨著MMP-9 表達增加或減少而呈現相反趨勢，這表明在平滑肌細胞中，MMP-9 能夠促進彈性蛋白水解，參與ECM 重塑過程。

miRNAs 是由19～25 個核苷酸組成的小分子單鏈非編碼RNA，具有高度保守性，以堿基互補配對的方式與靶基因mRNAs 的3＇-非編碼區特異性結合，轉錄后調控靶基因表達，參與大多數生物過程[17]。AAD 的發生、發展與miRNAs 的異常表達有關[18]。miR-183 在不同的生物中高度保守，其表達具有組織特異性。有研究報道，神經膠質瘤中miR-183 通過靶向IDH2，促進低氧誘導轉錄因子的表達，進而促進缺氧組織的血管生成[19]，miR-183 可通過上調IRS1 的表達，增強人臍帶血管內皮細胞活性，抑制炎癥水平，抵抗細胞損傷[20]。本研究發現，miR-183 在AAD 患者主動脈組織中明顯低表達，表明miR-183 在血管的病理生理過程中發揮了作用。為進一步探討miR-183 在AAD 中可能的分子機制，本研究用miR-183 模擬物和抑制物對HASMC 進行轉染，結果發現miR-183 與MMP-9 存在負性關系，因此筆者推測miR-183 可能是通過調控MMP-9 在AAD 患者體內發揮生物作用。

綜上所述，miR-183 在AAD 患者主動脈組織中低表達，MMP-9 蛋白則高表達，上調或下調miR-183 的表達能夠在mRNA 和蛋白水平上影響MMP-9的表達，從而改變Elastin 的表達水平。miRNA-183調控平滑肌細胞中MMP-9 的表達，參與主動脈中膜ECM 重塑過程，為AAD 發病機制的研究提供新思路。