基于轉錄組測序分析并驗證與肝癌預后相關的miRNA*

黃詩萍，廖舟翔，莫婉靈，李輝，楊麗超，黃雪靜，何敏,△

（廣西醫科大學 1.公共衛生學院；2.實驗動物中心，南寧 530021）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為22～24個核苷酸的非編碼小RNA，可在轉錄后水平調控基因表達。胞外的miRNAs主要存在于外泌體中或與蛋白質結合形成復合體，避免了核酸酶的降解，因此在血液或組織中能夠特異、穩定地檢測到miRNAs，使其有望成為理想的惡性腫瘤生物標志物[1-3]。

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中普遍存在異常表達的miRNAs，參與調控細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學過程[4]。而HCC細胞侵襲和轉移的特性是影響HCC患者術后復發、導致不良預后的重要因素。越來越多研究證明，miRNA表達水平與HCC患者的臨床病理特征相關，有望作為HCC預后的生物標志物[5-8]。但目前對于miRNA的研究仍處于探索階段，許多與HCC相關的miRNA尚未得到充分驗證[9]。

本次研究采用轉錄組RNA測序技術和生物信息學分析方法，篩選出差異表達的miRNAs，RT-qPCR驗證miR-429表達水平，利用數據庫和文獻分析miR-429與HCC患者預后的關系，為HCC預后監測提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常肝細胞HL7702和HCC細胞株Huh7、HepG2、Hep3B均購自中國科學院細胞庫（上海）；DMEM培養基、MEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑TrizolTM Reagent購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）購自上海生工公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物合成由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1轉錄組RNA測序HL7702、Huh7、HepG2、Hep3B 4種細胞總RNA抽提、質檢和文庫構建由深圳華大基因完成。使用DNBSEQ平臺進行樣本測序，對測序的原始數據中低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads進行過濾以保證結果的可靠性。得到clean reads之后，使用HISAT和Bowtie2進行人類參考基因組序列比對，得到轉錄本，計算后獲得基因表達量。

1.2.2差異表達基因的通路分析 采用DIANATOOLS數據庫中的miRPath V.3（http://www.microrna.gr/miRPathv3）對差異表達基因進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。使用KEGG進行信號通路分類注釋，以P＜0.05且FDR＜0.05為差異具有統計學意義。以P＜0.05為閾值進行篩選并進行可視化。火山圖和層次聚類分析熱圖分別用R語言（4.4.1版）的ggplot2和pheatmap包制作。

1.2.3生存分析用Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/）數據庫對篩選出來的miRNAs做生存分析。

1.2.4實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證miRNA

用TrizolTM Reagent提取正常肝細胞（HL7702）和HCC細胞（Huh7、HepG2、Hep3B）的總RNA，用miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑進行逆轉錄，反應條件：37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，30 min。PCR的反應參數如下：預變性95℃，30 s；變性95℃，10 s，退火和延伸60℃，30 s（40個循環）。以U6為內 參，用2-ΔΔCT法計算miR-429的相對表達量。miR-429上游引物序列為：5’-TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3’，U6上游引物以及下游通用引物來自miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒。

1.2.5文獻分析miR-429對PubMed、PHMC健康與醫學大全期刊全文庫、中國生物醫學文獻服務系統、中國知網和萬方數據庫進行檢索，收集國內外從建庫至2021年12月期間的文獻，中文檢索詞有“肝癌”與“miR-429”，英文檢索詞有“hepatocellular carcinoma”或“liver cancer”與“miR-429”或“miRNA-429”或“microRNA-429”或“miR-429”。文獻納入標準：（1）根據病理標準診斷的HCC病例對照、橫斷面或隊列研究；（2）研究中有具體樣本例數、miR-429的表達水平和miR-429與HCC預后關系的分析結果，有明確的分組信息。排除標準：符合以下任一標準則排除相關文獻或研究，（1）動物實驗、細胞實驗、綜述、病例報告、會議摘要、信函；（2）研究中缺乏明確的分組、樣本例數少于10例；（3）數據不完整或無法提取的研究。信息提取內容包括作者、發表時間、國籍、樣本類型、樣本量、影響miR-429表達的相關因素及與HCC患者預后相關的危險因素等研究內容。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選差異表達miRNAs

將正常肝細胞HL7702和HCC細胞株Huh7、HepG2、Hep3B進行全轉錄組測序，以HL7702為對照，兩兩比較分析測序結果顯示，與HL7702相比，miRNAs分別在Huh7細胞中有178個上調，159個下調，HepG2細胞有188個上調，163個下調，Hep3B細胞有202個上調，177個下調（圖1A～1C）。柱狀圖分別對應在Huh7、HepG2和Hep3B中表達上調和下調的miRNA個數，以及在3種HCC細胞中共同上調和下調的miRNA個數，在3種HCC細胞中共同上調的有39個，共同下調的有61個（圖1D）。進一步對HCC細胞中差異表達的這100個miRNAs進行層次聚類分析，可以直觀地看出在正常肝細胞和HCC細胞之間存在表達差異的miRNAs（圖1E）。

圖1 篩選正常肝細胞和HCC細胞間差異表達miRNAs

2.2 差異表達miRNAs的KEGG通路富集分析

將篩選出的100個差異表達miRNAs，放入DIANA TOOLS中的miRPath V.3進行KEGG通路 富集分析發現，差異表達miRNAs主要富集在多糖降解、癌癥中的蛋白聚糖、ErbB信號通路、黏著連接、調節干細胞多能性的信號通路、糖鞘脂生物合成—乳脂和新乳脂系列等信號通路。其中miR-429能夠在4條信號通路中被富集到，見表1和圖2。

表1 差異表達miRNAs的KEGG通路富集結果

圖2 差異表達miRNAs的KEGG通路富集熱圖

2.3 HCC患者中miR-429的生存分析

從KEGG信號通路富集結果來看，miR-429可富集到多條信號通路，因此選擇其進一步分析。用Kaplan-Meier plotter數據庫對其進行生存分析，發現miR-429表達高的HCC患者總體生存期較表達低者短（HR=1.63，95%CI：1.14～2.31，P=0.006 2），提示miR-429高表達是HCC患者生存時間的危險因素，見圖3。

圖3 miR-429的生存分析

2.4 miR-429表達水平的RT-qPCR實驗驗證

轉錄組RNA測序結果顯示miR-429在Huh7、HepG2和Hep3B表達升高（圖4A），采用RT-qPCR驗證miR-429在4種細胞中的表達情況，結果顯示，與正常肝細胞HL7702比較，miR-429在Huh7、HepG2和Hep3B細胞中的表達均升高（P＜0.05），與RNA測序結果一致，見圖4B。

圖4 miR-429的表達水平分析

2.5 文獻分析miR-429

根據文獻檢索策略，共檢出文獻46篇，刪除重復文獻后，閱讀標題和摘要進行初篩，進一步仔細閱讀全文，最終選擇3篇文獻進行分析[10-12]。文獻篩選過程見圖5A。三項研究顯示miR-429在HCC組織和HCC細胞中高表達，并且高miR-429表達與HCC的不良預后相關，HCC患者中miR-429越高，無復發（無病）生存期和總體生存期越短。Huang等[10]和Li等[11]的研究中通過多因素分析發現，miR-429是HCC患者生存時間的危險因素。見表2、圖5B。

表2 納入文獻的信息

圖5 文獻分析miR-429

3 討論

本研究通過對差異表達的miRNAs進行KEGG通路富集分析，發現了差異表達的miRNAs主要富集在多糖降解，癌癥中的蛋白聚糖，ErbB信號通路，黏著連接，調節干細胞多能性的信號通路，糖鞘脂生物合成—乳脂和新乳脂系列等信號通路。其中ErbB屬于表皮生長因子受體家族（epidermal growth factor receptor family），是一類能夠參與惡性腫瘤發生發展的重要蛋白。ErbB受體家族受體的激活（通過同源或異二聚體）觸發兩條主要的下游通路，PI3K/AKT和MAPK信號通路[13]。Wang等[14]的研究表明ErbB3通過C端的磷酸化激活位點，可與PI3K結合，從而激活PI3K/AKT信號通路，促進了膀胱癌的增殖和上皮間充質轉化過程。Li等[15]的研究發現ErbB2可以激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，促進宮頸癌細胞的增殖。

本研究發現miR-429出現在多條富集的信號通路上，可能是一個重要的與HCC相關的miRNA。就目前的報道看，miR-429一方面在腎癌、乳腺癌、胃癌、膠質瘤、食管癌、口腔鱗狀細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌等癌癥中充當抑癌基因，另一方面在前列腺癌、子宮內膜癌、肺癌中充當促癌基因，而在HCC、結直腸癌、膀胱癌和卵巢癌中的角色則是矛盾的[9]。聚焦在HCC相關研究時，可以發現miR-429有兩種不同的異常表達模式：（1）miR-429在HCC組織和HCC細胞中低表達，可以通過直接結合靶基因或被lncRNA負調控，影響HCC細胞的增殖、凋亡和上皮間質轉化等過程[16-18]，或者與靶基因結合后再調控Raf/MEK/ERK-EMT、NF-κB等信號通路，影響HCC細胞的遷移、侵襲等生物學行為[19-20]，但與HCC的預后關系不明；（2）miR-429在HCC組織和HCC細胞中高表達，miR-429可以促進HCC細胞增殖、抑制凋亡[10]，通過靶向RBBP4/E2F1/OCT4軸調控肝臟腫瘤形成細胞[11]，還可以靶向結合PTEN基因，導致PI3K/AKT信號通路激活，介導HCC細胞的轉移[12]。這三項研究報道了miR-429的表達水平和腫瘤大小或數量、微血管浸潤、腫瘤分期等臨床病理特征相關，還和黃曲霉毒素暴露、乙型肝炎e抗原陽性存在相關性；學者們通過Kaplan-Meier分析發現miR-429過表達和HCC患者無復發（無病）生存率和總體生存率越低呈顯著相關，多個研究的多因素分析結果還表明了miR-429是HCC患者生存時間的危險因素[10-12]。本研究的轉錄組RNA測序和RT-qPCR結果顯示miR-429在3種HCC細胞中高表達，這和Li等[11]所報道的表達趨勢基本一致。通過數據庫分析和文獻分析發現了miR-429表達高的HCC患者生存期較表達低者短。這些證據提示了miR-429可以調控HCC的發生發展和影響HCC患者預后，其可能是一個潛在的腫瘤治療靶點或預后監測指標，但需要多中心的臨床數據進一步驗證。