半乳凝集素3在小鼠肺缺血再灌注損傷中的表達(dá)*

劉豪，何小靜，劉春霞，覃 伊，伍思怡，趙 晨，林飛

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是指當(dāng)肺組織缺血缺氧一段時(shí)間重新建立血流和通氣時(shí)，先前缺血的肺臟會(huì)加劇缺血性損傷并導(dǎo)致微血管通透性和肺血管阻力增加以及免疫反應(yīng)強(qiáng)烈激活的一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程[1-2]。LIRI是一種復(fù)雜的“無(wú)菌性”炎癥，被認(rèn)為與血管通透性增加以及細(xì)胞因子和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活直接相關(guān)[3]，先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活可導(dǎo)致肺損傷[4]，但是對(duì)于LIRI發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控機(jī)制目前尚未闡明，臨床上仍缺乏有效的防治手段。

半乳凝集素3（galectin 3，Gal3）是一種結(jié)合β-半乳糖苷的凝集素，高度保守并廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外[5]。近年來(lái)，Gal3被認(rèn)為是一種新型炎癥因子，參與血管內(nèi)炎癥、巨噬細(xì)胞活化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞黏附等過(guò)程[6-7]。有研究證實(shí)，Gal3可以促進(jìn)組織器官的免疫炎癥反應(yīng)，激活炎癥小體，促進(jìn)細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征，導(dǎo)致組織損傷和炎癥爆發(fā)[8-10]。但是Gal3在LIRI中的作用機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)建立小鼠LIRI模型，探討Gal3在LIRI中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)健康的SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠20只，動(dòng)物合格證號(hào)：202006019。體重（20±5）g，6～8周齡，以12 h光照/黑暗交替循環(huán)飼養(yǎng)，期間自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑與材料

蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒（#G1120）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（#CSB-E04741m、#CSB-E08054m）購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司。免疫熒光染色相關(guān)試劑（#P0265、#P0262、#P0260、#P0131）和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0010）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒和Tli RNaseH Plus定量試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司。一抗：β-actin兔單克隆抗體（#4970）購(gòu)自美國(guó)CST公司，稀釋倍數(shù)為1∶1 000；Gal3小鼠單克隆抗體（#ab2785）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，稀釋倍數(shù)為1∶1 000，免疫熒光染色稀釋倍數(shù)為1∶200。二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司：山羊抗兔IgG H&L（IRDye?800CW）預(yù)吸附二抗（#ab216773）、山羊抗小鼠IgG H&L（IRDye?800CW）預(yù)吸附二抗（ab216772），稀釋倍數(shù)為1∶15 000；山羊抗小鼠IgG H&L（#ab97020）用于免疫熒光染色，稀釋倍數(shù)為1∶500。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組與處理20只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和4組實(shí)驗(yàn)組（即LIRI后2 h組、LIRI后6 h組、LIRI后12 h組、LIRI后24 h組），每組4只。所有小鼠備皮后經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥（50 mg/kg）進(jìn)行麻醉、固定，行氣管通氣[11]。于小鼠左側(cè)胸骨第3～4肋間位置切開(kāi)皮膚，然后逐層鈍性分離，直至暴露左肺，找到左肺門(mén)后使用無(wú)損顯微血管夾夾閉肺門(mén)，可觀察到左肺不再通氣，夾閉60 min后松開(kāi)血管夾，逐層進(jìn)行縫合。其中假手術(shù)組只開(kāi)胸不夾閉肺門(mén)，于開(kāi)胸后60 min處死小鼠；各實(shí)驗(yàn)組分別于松開(kāi)血管夾后2 h、6 h、12 h、24 h處死小鼠。收集各組左肺標(biāo)本，儲(chǔ)存于-80℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 取小鼠左肺組織，置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后切成5μm厚的組織薄片，置于載玻片上，切片常規(guī)HE染色封片后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，拍照。參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺損傷程度進(jìn)行評(píng)分[12]。

1.3.3支氣管肺泡灌洗液（BALF）提取 小鼠被處死后，從主支氣管用1 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）灌注左肺以收集BALF。收集的液體在4℃、1 500 r/min條件下離心10 min，取上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 ELISA檢測(cè)BALF中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)量 將提取的BALF按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)肺組織Gal3 mRNA表達(dá)量用TRIzol法提取肺組織的總RNA后，檢測(cè)RNA的純度和濃度，按照cDNA合成試劑盒步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將cDNA按Tli RNaseH Plus定量試劑盒步驟進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，檢測(cè)Gal3 mRNA表達(dá)（ABI 7900型熒光定量PCR儀），使用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列：上游，5’-AGGTCGGTGTGAACG-GATTTG-3’，下游，5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’；Gal3的引物序列，上游：5’-AGACAGCTTTTCGCTTAACGA-3’，下 游，5’-GGGTAGGCACTAGGAGGAGC-3’。

1.3.6 Western blotting法檢測(cè)肺組織Gal3蛋白表達(dá)量 提取肺組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以50μg蛋白量上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉60 min后洗膜，將PVDF膜置于稀釋的一抗中4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后將PVDF膜置于對(duì)應(yīng)的二抗中室溫孵育1 h，使用Alpha Innotech化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3.7免疫熒光染色檢測(cè)肺組織Gal3表達(dá) 將肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，使用1×（pH=6）檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，QuickBlock?免疫染色封閉液封閉10 min，滴加一抗后在4℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日，PBS沖洗切片，滴加二抗后室溫孵育50 min，PBS沖洗，用含DAPI抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)和W/D變化

假手術(shù)組的肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺間質(zhì)無(wú)充血和水腫，肺泡間隔完整，腔內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與假手術(shù)組相比，LIRI后不同時(shí)間肺組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的損傷：LIRI后2 h出現(xiàn)肺損傷，肺泡壁輕度增厚，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；在LIRI后6 h達(dá)到高峰，可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡間隔明顯增厚，大小不一，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出；隨著LIRI后時(shí)間延長(zhǎng)肺組織損傷程度逐漸減輕。與假手術(shù)組相比，各實(shí)驗(yàn)組肺組織損傷評(píng)分和肺組織W/D均有所升高（均P＜0.05）；其中LIRI后6 h組肺損傷評(píng)分和W/D高于其他實(shí)驗(yàn)組（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織病理學(xué)和W/D變化

2.2 小鼠BALF中炎性因子表達(dá)水平的變化

與假手術(shù)組相比，在LIRI發(fā)生后各實(shí)驗(yàn)組小鼠BALF中IL-1β和TNF-α 的表達(dá)均逐漸升高（均P＜0.05），均在LIRI后6 h組達(dá)到高峰（均P＜0.05），隨后逐漸下降，見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠BALF中IL-1β和TNF-α表達(dá)變化

2.3 小鼠肺組織中Gal3 mRNA表達(dá)水平的變化

與假手術(shù)組比較，在各實(shí)驗(yàn)組中Gal3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在LIRI后6 h組達(dá)到高峰后逐漸降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠肺組織中Gal3 mRNA表達(dá)量變化

2.4 小鼠肺組織中Gal3 蛋白表達(dá)水平的變化

與假手術(shù)組比較，各實(shí)驗(yàn)組中Gal3蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05），在LIRI后6 h組達(dá)到高峰，然后逐漸降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 小鼠肺組織中Gal3蛋白表達(dá)量變化

2.5 小鼠肺組織中Gal3 免疫熒光表達(dá)水平的變化

與假手術(shù)組相比，各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量增多，在LIRI后6 h組達(dá)到峰值，隨后逐漸減弱，見(jiàn)圖5。

圖5 小鼠肺組織中Gal3表達(dá)量免疫熒光染色圖（×400）

3 討論

LIRI是肺移植、心臟搭橋、心肺復(fù)蘇等疾病的主要并發(fā)癥之一[13]，其致病機(jī)制復(fù)雜，主要特征是微血管通透性增加、肺血管阻力增加，引起一系列強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，釋放大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致爆發(fā)性炎性反應(yīng)，造成肺水腫和氧合受損，最終導(dǎo)致組織損傷[4，14]。本研究結(jié)果表明，LIRI發(fā)生后肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫，不同程度的紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷病理學(xué)評(píng)分升高，肺組織W/D增加，同時(shí)BALF中IL-1β和TNF-α 水平升高。

Gal3是半乳凝集素家族的重要成員之一，能夠通過(guò)凝集素—碳水化合物相互作用寡聚化并參與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)聚糖的多價(jià)相互作用，從而影響細(xì)胞功能，在各種器官的許多生物活動(dòng)中起重要作用，是炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑[15]。Gal3被認(rèn)為是一種穩(wěn)定的生物標(biāo)記物，在正常情況下其在體內(nèi)表達(dá)水平與體重、年齡、性別無(wú)關(guān)，很容易從受損細(xì)胞和炎癥細(xì)胞分泌到細(xì)胞表面和生物體液（如血清和尿液）中，因此Gal3可作為多種疾病早期潛在的生物標(biāo)志物，用于疾病診斷或預(yù)后情況預(yù)測(cè)[16-17]。研究表明，Gal3在博來(lái)霉素和LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的表達(dá)升高，下調(diào)Gal3表達(dá)后可減輕急性肺損傷和炎癥反應(yīng)[18]，提示Gal3可能在LIRI中發(fā)揮重要作用。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，Gal3參與了器官缺血性疾病的發(fā)生和發(fā)展，Gal3在腎功能衰竭和急性心肌梗死中的表達(dá)均上調(diào)，敲低Gal3可以減組織損傷和細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，LIRI會(huì)導(dǎo)致肺組織嚴(yán)重?fù)p傷，肺組織充血水腫，炎性因子表達(dá)升高。采用RT-qPCR法、Western blotting法和免疫熒光染色法檢測(cè)Gal3的表達(dá)，結(jié)果表明，在LIRI發(fā)生后Gal3升高，并在LIRI后6 h達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)，與肺組織損傷和炎癥反應(yīng)的變化一致。提示高水平的Gal3可能與LIRI早期免疫調(diào)控有關(guān)。

綜上，在小鼠LIRI中Gal3的表達(dá)水平升高，肺組織損傷嚴(yán)重，炎性因子分泌增多，Gal3可能參與調(diào)控小鼠LIRI病理變化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。