干旱脅迫下不同欒樹無性系生理生化特征研究

劉金秋曹幫華王甜甜郝明慧陳珍

(1.山東省地質科學研究院，山東 濟南 250013；2.山東農業大學 林學院，山東 泰安 271001；3.東營市濕地城市建設推進中心，山東 東營 257091)

0 引言

2001—2016年中國年均農業干旱受災面積為179 910 km2，約占自然災害總受災面積的50%，為各項災害之首[1]。近年來，占國土面積約60%的中國北方地區干旱化問題突出[1]。研究植物的抗旱性并在此基礎上進行良種選育，對林業生產及推廣應用具有重要意義。植物在長期適應干旱環境過程中，形成了逃旱性、御旱性、耐旱性和復水恢復性[2]。目前，植物抗旱性研究主要集中在3個方面[3-5]形態特征、生長特性和生理生化變化。對樹木結構、保護酶體系、滲透調節物質、葉綠素質量分數、細胞膜透性、光合機制等皆有研究，并取得了較大進展。對干旱條件下植物種子、葉片及根系均有研究，以葉片研究居多[6-8]，對植物根系的研究主要集中在根系結構、分布特征等方面[8-11]。關于根系活力與干旱脅迫關系，主要集中在典型的荒漠植物如梭梭[10]、紅砂[11]等。近年來，隨著從分子水平探討植物抗旱機理的開展，植物抗旱性研究不斷深入[12-13]。

欒樹(Koelreuteria bipinnata)分布較廣泛，北起東北的南部，南到長江流域地區，西至甘肅均有分布[14]。目前，欒樹的抗旱性研究主要涉及生長速率、葉片生理生化特征等，但對持續干旱下形態學、復水恢復性、根系活力等的研究較少，且多是與其他樹種間的比較，而欒樹種間抗旱性研究較少；而在材料選擇方面，以實生苗抗旱性研究居多，對嫁接、扦插等無性系抗旱性研究較少[15-17]。

2015年收集、保存并建立欒樹無性系5種，無性系性狀表現突出，部分性狀區別于欒樹，優于當地栽培的欒樹品種。自2017年起用欒樹實生苗作為砧木，將5種株系進行了扦插試驗，選取其中3種(L1、L2、L3)一年生扦插苗進行抗旱性對比試驗，通過形態觀測、復水恢復、根系活力以及葉片生理生化指標等方面比較研究其抗旱性，以期為生產應用、良種選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以3種不同樹皮顏色的欒樹觀賞無性系L1、L2、L3為試驗材料，其中L1、L2、L3樹皮顏色分別為灰黑色、褐綠色、灰綠色。選擇生長健壯、大小一致的3種無性系一年生扦插苗定植于35 cm×30 cm(高×內徑)的塑料營養盆中，每盆1株，統一管理，每種無性系有30株，總計90株。

1.2 試驗地點

試驗地點位于山東省東營市六干苗圃。其屬暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫為12.5℃、極端最高氣溫為40.7℃、極端最低氣溫為-20.2℃、無霜期為211 d、≥10℃的積溫約為4 300℃；年降水量為550～600 mm，多集中在夏季，占全年降水量的65%。土壤質地以褐土、砂姜黑土、潮土、鹽土及水稻土等為主，其pH值為5.5～6.5。室內生理生化試驗在東營市園林局生理生化實驗室進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

每個品種設干旱和對照(正常澆水)兩個處理，干旱處理每種無性系5株，經3次重復共計15株，對照處理每種無性系3株。對所有無性系澆水至土壤水分飽和(以盆底有水滲出為準)后進行自然干旱處理，對照植株保持正常澆水。

干旱處理植株每隔5 d測定土壤含水量，記錄形態變化并取相同位置葉片測定相關生理生化指標，總計9次。干旱脅迫第32天上午10:00測定凈光合速率；第36天測定根系活力、葉比重、根冠比；第40天測定葉片含水量；第42天對干旱脅迫植株復水并于15 d后觀測植株成活情況。

1.3.2 指標及測定方法

(1)形態觀測

觀測持續干旱條件下，不同欒樹無性系隨干旱天數的增加，葉片及嫩莖萎蔫、干枯及變色開始的天數、株樹、程度以及復水后的表現。

(2)含水量

土壤含水量、葉片含水量采用烘干稱重法測定。

(3)葉綠素質量分數

采用SPAD-502葉綠素儀測定。

(4)根系活力

采用氯化三苯基四氮唑法測定[13]。

(5)根冠比、葉比重

根冠比=根鮮重/地上部鮮重，葉比重=葉鮮重/植株總鮮重。

(6)凈光合速率

采用Li-6400XT光合儀測定。

(7)脯氨酸質量分數

采用磺基水楊酸提取，茚三酮顯色法測定[13]。

(8)酶活性測定

過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創木酚顯色法測定。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑比色法測定[18]。

(9)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)

采用硫代巴比妥酸比色法測定[18]。

1.3.3 數據處理與分析

利用電子表格Excel軟件進行數據歸類整理、作圖，采用統計產品與服務解決方案(Statistical Product and Service Solutions，SPSS)軟件進行單因素方差分析，差異顯著性運用鄧肯Duncan檢驗法進行多重比較，顯著性水平設定α=0.05，極顯著水平設定α=0.01，并標出標準誤差。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下3種欒樹無性系苗木形態特征

樹木形態特征是干旱脅迫的綜合影響結果，表觀反映了植物抗旱能力。干旱脅迫下3種無性系形態特征變化見表1，所有無性系在干旱脅迫前均生長正常。脅迫至第10天出現葉片萎蔫癥狀，萎蔫率分別為93.33%、20.0%、40.0%。脅迫至第15天所有無性系均出現葉片萎蔫癥狀，L1、L2、L3黃葉率依次為26.67%、40.0%、20.0%。脅迫至第25天所有植株底部葉片變紅，葉緣干枯。脅迫至第30～35天枯葉數量增多，嫩莖變紅變細。脅迫至第40天欒樹L1葉片全部出現干枯、嫩莖變紅現象，其中4株葉片失綠，L2中9株枯葉已至頂端，L3中5株干枯較嚴重，其中1株葉片接近全紅。綜合比較，欒樹L1葉片萎蔫、脫落最為嚴重，而L3的最輕。

表1 干旱脅迫對3種欒樹無性系苗木形態特征的影響統計表

植物在干旱和復水過程中的干旱適應性，既包括了抗旱能力又包括了復水后的恢復能力[19]。提高植物抗旱性的同時，提高植物的恢復能力對于適應低水環境、保證植物生產也具有重要意義[20]。復水15 d后，L1所有植株無死亡，成活率100%，成活植株平均每株保留活葉20片，其中5株葉片幾乎完全脫落，重新長出新芽；L2有2株死亡，成活率為86.67%，成活植株平均每株保留活葉19片，大部分僅留少量枝葉，其中4株萌發新芽；L3有4株死亡，成活率為73.33%，成活植株平均每株保留活葉42片。從復水存活植株葉片情況看，L1成活植株平均每株存活葉片20片、L2為19片、L3為42片，L3保留活葉量最多，與L1、L2的葉片脫落嚴重形成顯著對比。復水后成活率為L1＞L2＞L3，表現出了其抗旱性的差異，L3成活植株的生長恢復能力高于L1、L2，表明L3復水后的恢復能力最強。

2.2 干旱脅迫下3種欒樹無性系土壤含水量變化

采用烘干稱重法對土壤絕對含水量進行測定，并計算土壤相對含水量。土壤相對含水量=土壤絕對含水量/田間持水量，經測定田間持水量為29.32%。土壤含水量變化情況如圖1所示。由圖1可知，隨著干旱脅迫時間的延長，土壤相對含水量逐漸下降，通過對土壤含水量方差分析表明，不同干旱脅迫時間下各無性系土壤含水量差異極顯著(P＜0.01)，相同脅迫時間下各無性系土壤含水量差異不顯著(P＞0.05)。進一步多重比較，各無性系在干旱脅迫前5 d土壤含水量與其他脅迫時間土壤含水量差異顯著，而第10天至第40天彼此之間差異不顯著。第10天土壤含水量下降較快，從第10天往后，土壤含水量下降較為平緩，其原因是苗木葉片數量及蒸騰能力下降，至第15天所有無性系土壤相對含水量已＜32%，達到嚴重干旱水平。

圖1 干旱脅迫下3種欒樹無性系土壤含水量變化圖

2.3 干旱脅迫下3種欒樹無性系葉片含水量及凈光合速率變化

持續干旱至第40天對葉片含水量進行測定，第32天對葉片凈光合速率進行測定，變化情況見表2。L1、L2、L3各無性系的葉片含水量分別為22.94%±0.15%、28.24%±0.03%和31.23%±0.02%，通過方差分析表明，不同無性系葉片含水量差異極顯著(P＜0.01)，3組正常澆水葉片含水量分別為62.0%±0.18%、65.50%±0.10%、61.60%±0.06%，無顯著差異(P＞0.05)。與對照相比，L1、L2、L3的葉片含水量分別降低了63.08%、56.89%和49.31%。3種欒樹無性系葉片含水量較對照處理下降幅度大小依次為L1＞L2＞L3，由此可推斷L3葉片保水能力最好，而L1最差。

表2 干旱脅迫下3種欒樹無性系葉片含水量及光合速率的變化表

植物利用光能固定大氣中的二氧化碳CO2合成有機物的過程被稱為光合作用，常受生物和非生物脅迫的抑制[21]。水分脅迫可顯著抑制光合色素的合成，進而降低了水分和鹽分脅迫對植株的傷害[22]。植物的光合速率是影響植物產量和品質的重要因素，一定程度上可評價無性系抗旱性的優劣[23]。持續干旱第32天，各無性系及各自正常澆水對照組的凈光合速率測定結果表明，各無性系凈光合速率全部低于對照，L1、L2、L3與對照處理相比分別降低了188.25%、171.85%、135.69%，無性系間差異極顯著(P＜0.01)。正常澆水對照組差異不顯著(P＞0.05)。3種欒樹無性系葉片凈光合速率較對照下降幅度大小排序為L1＞L2＞L3，表明L3葉片所受損傷最小，而L1的損傷最大。

2.4 干旱脅迫下3種欒樹無性系葉綠素質量分數變化

在干旱脅迫下，葉片的葉綠素發生降解，質量分數降低，抗旱性較強的種類葉綠素質量分數通常能維持在較高水平[24]。SPAD-502葉綠素儀是一種輕便的葉綠素檢測儀，田間直接測定的SPAD值可以較好的反映植物葉片葉綠素質量分數且其測定方法不會對植物葉片造成損害[25]。各無性系葉綠素質量分數變化見表3。3種無性系葉片葉綠素總質量分數的變化情況趨于一致，均表現為先降低再升高再降低的趨勢，表明欒樹葉片葉綠素質量分數對于輕度、中度干旱反應較為敏感，葉綠素質量分數有所下降，然后通過自調節使葉綠素質量分數略微下降。通過方差分析，表明不同無性系、不同干旱脅迫時間下各無性系間變化差異不顯著(P＞0.05)，欒樹各無性系抗旱性均較強。

表3 干旱脅迫下3種欒樹無性系葉片葉綠素質量分數統計表

2.5 干旱脅迫下3種欒樹無性系根系活力、葉比重、根冠比變化

植物根系相對不易缺水是因為土壤中常有一定的可用水。而地上部分依靠根系供給水分，枝葉大量蒸騰，更容易水分虧缺，因此土壤水分降低對地上部分的影響大于對根系的影響，植物根冠比的大小反映了植物地下部分與地上部分的相關關系[26]。根系是植株的重要部分，其生長狀況好壞直接影響著植株的生長和代謝[27]。土壤含水量低于一定的臨界值后，苗木根系將逐步喪失其活力和功能，最終死亡。在持續干旱第36天對各無性系根系活力、葉比重、根冠比測定，并與各自正常澆水對照比較。根系活力、葉比重、根冠比情況見表4，持續干旱脅迫下，隨著土壤含水量的降低，L1、L2、L3的根系活力變化趨勢相同，總體呈下降趨勢，相比對照分別下降了35.0%、33.98%、28.17%，且差異顯著(P＜0.05)。由于不同無性系的對照之間根系活力存在差異，正常澆水對照根系活力從高到低排序為L1＞L2＞L3，干旱處理后根系活力從高到低排序仍為L1＞L2＞L3，說明L1根系活力最強，L2的次之，而L3的最差。試驗中根系活力測定于干旱脅迫第36天，根系活力排序與復水后成活率排序相吻合。

統計各無性系生物量比重(見表4)可以發現，葉比重L1、L2、L3分別為27.34%、28.66%、30.85%，比對照分別減少10.57%、3.68%、7.45%，各組間差異極顯著(P＜0.01)。葉比重下降幅度為L1＞L3＞L2。L1根冠比為51.31%，比對照上升16.22%，L2的為32.11%，比對照下降4.33%，L3的為28.61%，比對照下降7.83%，各組間差異極顯著(P＜0.01)。適應干旱的植物根冠比較大，能更有效地利用土壤深處水分，潘瑞熾[28]通過對農作物抗旱研究，發現根冠比與植物的抗旱性成正比。L2、L3根冠比變化情況與陳吉虎[29]對欒樹干旱后根冠比下降的研究一致，L1根冠比上升，表明L1相比于L2、L3的抗旱性更強。結合形態觀察，L1葉片萎蔫、下垂、脫落時間均早于L2、L3，至脅迫后期葉比重下降最大，但是根系活力、根冠比均高于L2、L3，由此可以推斷L1可能是通過葉片脫落減少蒸騰以此適應環境變化，加強對自身保護，植株將營養更多地保存于根系，在復水后即使葉片很少也能快速長出新芽，適應干旱脅迫帶來的傷害而保持高存活率。

表4 各無性系根系活力、葉比重、根冠比統計表

2.6 干旱脅迫下3種欒樹無性系脯氨酸質量分數變化

脯氨酸是重要的滲透調節物質，干旱脅迫下的積累，能夠增加植物的吸水、保水能力，維持各項代謝正常進行[24]。脯氨酸的質量分數與植物的抗旱能力成正比[30]。干旱脅迫下脯氨酸質量分數變化如圖2所示。隨著土壤含水量的降低，欒樹3種無性系的脯氨酸質量分數變化大體趨勢相同，呈干旱脅迫前35 d增加，之后迅速下降的趨勢。在反應的時間先后上又有區別，其中L1前5 d迅速增加，之后緩慢增加，L2階梯性增加，L3近乎直線增加，之后所有無性系呈現平緩上升，至第35天呈現峰值再快速下降。在干旱脅迫前15 d，L1、L2的增加幅度顯著大于L3。L1最早快速增加，表明面臨干旱脅迫能夠快速積累脯氨酸，以增加自身吸水、保水能力，維持各項代謝的正常運行，之后保持在一個相對較高的水平直至峰值；L2階梯性增長，至第15天后快速增加，在第20～35天保持較高水平；L3反應最為緩慢，近乎直線增加，直至第35天峰值。L1、L2、L3脯氨酸質量分數的增加幅度分別上升了1152.16%、400.64%、553.83%，差異極顯著(P＜0.01)，排序為L1＞L3＞L2，滲透調節能力L1＞L3＞L2。第35天之后所有的無性系脯氨酸質量分數快速下降，表明干旱脅迫已超出了欒樹各無性系所能承受的最大限度，缺水已對其細胞生理功能造成了不可逆轉的傷害。

圖2 干旱脅迫下3種欒樹無性系脯氨酸質量分數變化圖

2.7 干旱脅迫下3種欒樹無性系保護酶活性變化

2.7.1 POD活性變化

干旱脅迫時植物會產生傷害植物細胞的活性氧，但是植物體內具有清除活性氧的防御保護體系，植物體內的活性氧自由基清除劑抗氧化酶體系，在逆境中能使植物通過提高其活性，減少活性氧對植株的傷害，維持細胞膜的穩定性。酶的活性是鑒定植物抗逆性的重要指標，酶活性越大清除危害物的能力就越大。POD活性是衡量植物抗旱能力的重要指標之一，也是細胞內防御酶系統中重要的清除酶之一[31]，可清除植物體內過多的過氧化氫(H2O2)等過氧化物，防止H2O2對細胞膜造成傷害。干旱脅迫下POD活性升高可以保護植物細胞膜的結構，其活性升高的原因是活性氧的增加刺激了清除酶系統的活性[32]。POD活性變化如圖3(a)所示。持續干旱脅迫下，隨著土壤含水量的降低，欒樹3種無性系葉片的POD活性變化大體趨勢相同，呈現前30 d增加，之后下降的趨勢。在增加的時間先后上有所區別，前5 d各無性系SOD活性增加緩慢，第10天開始，L1、L3增速加快，近乎直線增加，L2呈階梯式增加，第10～20天增加稍慢，第20天開始迅速增加，所有無性系POD活性在脅迫第25～30天保持相對較高水平，自第30天開始迅速下降。L1、L2、L3的增加幅度分別上升了575.0%、361.11%、300.0%，差異極顯著(P＜0.01)。POD活性變化排序為L1＞L2＞L3，一定程度上表明了3種無性系的抗旱能力L1＞L2＞L3。

2.7.2 SOD活性變化

SOD可以將植物體內有害的超氧自由基轉化為過氧化物，再由POD轉化為無危害的水[33]。SOD活性變化如圖3(b)所示。持續干旱脅迫下，隨著土壤含水量的降低，SOD活性隨著脅迫程度的加劇而升高，在脅迫末期迅速下降，表明保護酶活性的降低，植物傷害不可逆。前35 d各個無性系趨于一致，持續增加，至第35天峰值后所有無性系SOD活性下降。在增加幅度上，L1、L2、L3的SOD活性分別上升了438.81%、304.26%、413.58%，差異極顯著(P＜0.01)，排序為L1＞L3＞L2，其抗旱能力的排序為L1＞L3＞L2。

圖3 干旱脅迫下3種欒樹無性系保護酶活性變化圖

2.8 干旱脅迫下3種欒樹無性系MDA質量摩爾濃度變化

MDA是脂膜過氧化的產物，逆境時會大量累積[34]。賈恢先等[35]、王雅靜[36]研究了植物逆境脅迫下細胞脂質過氧化與其他生理指標存在相關性。MDA值越高，表明植物傷害越嚴重。MDA質量摩爾濃度變化如圖4所示。在土壤持續干旱脅迫的條件下，3種欒樹無性系的MDA質量摩爾濃度隨著干旱脅迫的加劇呈現升高-降低-升高的趨勢。干旱脅迫結束時，L1、L2、L3的MDA質量摩爾濃度分別上升了62.37%、95.57%、233.49%，差異顯著(P＜0.05)。增加幅度排序為L3＞L2＞L1，說明植物受傷害程度排序為L3＞L2＞L1。

圖4 干旱脅迫下3種欒樹無性系MDA質量摩爾濃度變化圖

SOD活性、POD活性、脯氨酸質量分數均表現為干旱脅迫前期不斷上升，并且在第35天到達峰值后迅速降低；而MDA質量摩爾濃度在持續干旱前15 d升高，然后降低，至第35天波動后迅速增加。持續干旱前15 d干旱程度逐漸加劇對細胞膜造成傷害，脯氨酸質量分數、SOD活性和POD活性不斷上升，說明植物在干旱條件下通過調節機制抵御外界不良環境對自身的傷害，減弱膜脂過氧化的程度，相互之間協同發揮作用，有利于清除活性氧，從而減輕質膜的損傷，維持細胞膜的損傷與修復，保持兩者之間的動態平衡。持續干旱至第35天，脯氨酸質量分數、SOD活性和POD活性達到峰值，同時MDA質量摩爾濃度最低。之后脯氨酸質量分數、SOD活性和POD活性迅速下降，而MDA質量摩爾濃度則迅速增高，說明MDA和滲透調節物質、保護酶之間對細胞膜的損傷與修復有協調關系。隨著干旱進一步的加劇，滲透調節物質、保護酶作用降低，植物傷害不可逆。

試驗確定干旱脅迫強度是通過盆栽控水實現的，植株大小方面欒樹L1略高于L2、L3，所以在相同起點的盆栽供水條件下，各苗木所受的干旱脅迫強度和所能夠利用的有效水分實際上不是完全一致的，如要更精確的抗旱評價，可結合生長狀況綜合判定。試驗從干旱脅迫開始至復水的持續時間為42 d，干旱脅迫天數較長，但從統計的總的存活率來看，86.7%的欒樹幼苗可以在嚴重干旱的土壤環境下存活時間＞27 d。試驗期間棚外降雨較多，空氣濕度加大，葉片吸水量增加，土壤干旱和大氣干旱都會導致植物水分虧缺[5]，大氣水分在一定程度上延長了植株的抗干旱脅迫時間。

3 結論

通過上述研究可知:

(1)隨著干旱脅迫程度加深，土壤含水量逐漸降低，3種不同樹皮顏色的欒樹無性系品種均出現不同程度的形態特征變化。干旱后復水15 d時，L1、L2、L3的存活率分別為100.0%、86.67%、73.33%，表明耐干旱脅迫能力L1＞L2＞L3。

(2)隨干旱脅迫的加劇，3種無性系葉片含水量和凈光合速率均降低，葉片含水量下降幅度大小排序為L1＞L2＞L3，凈光合速率下降幅度大小排序為L1＞L2＞L3；葉綠素質量分數的變化差異不顯著，葉比重均降低，L1的根冠比升高，而L2、L3的降低。

(3)在干旱脅迫加劇的過程中，3種無性系的葉片保護酶POD和SOD活性、脯氨酸質量分數和MDA質量摩爾濃度之間存在動態平衡關系。隨著干旱脅迫加劇，脯氨酸質量分數呈現出先升高后降低的變化趨勢，脯氨酸質量分數的增加幅度為L1＞L2＞L3；POD活性、SOD活性均表現為先升高后降低的變化趨勢，MDA質量摩爾濃度則表現為先升高后降低再升高的變化趨勢，保護酶活性的增加幅度為L1＞L2＞L3。

(4)綜合評定3種欒樹無性系的耐干旱脅迫能力由高到低排序為L1、L2、L3。