蕭縣葡萄皮中可溶性膳食纖維的提取及其抗氧化性研究

王 晴，周 雪，錢玉梅，曹穩根

(1.宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000；2. 宿州市天然產物與功能性食品工程技術研究中心，安徽 宿州 234000)

蕭縣是我國四大葡萄種植區之一，位于蘇魯豫皖四省交界處，地處黃河故道，土地疏松，有良好的氣候和土壤條件供葡萄生長，因此有“葡萄之鄉”的美譽.蕭縣葡萄品種多達100種，為宿州蕭縣當地的經濟發展提供了巨大的幫助，同時也順應了特色產業扶貧的政治決策，但隨著蕭縣葡萄種植業及其加工業的飛速發展，大量的葡萄廢棄物隨之產生.葡萄皮，是釀酒和葡萄汁等葡萄制品加工過程中大量產生的一種副產物，含量高達葡萄加工量的20%-30%.國內外研究數據表明，葡萄皮中含有多種生物活性物質，其中膳食纖維含量占葡萄皮的60%以上.如果能合理開發利用這部分資源，將帶來巨大的經濟效益.當前，國外對葡萄皮廢棄物的應用比較廣泛，但我國對葡萄皮中膳食纖維的研究尚淺，仍處于初級階段，尤其在膳食纖維的制備、檢驗方法方面更是缺乏[1]，加工利用效率低，造成了大量資源的浪費.膳食纖維，是指食物中不被人體胃腸道消化酶所分解的、不可消化成分的總和，可作為人類食用的一種食品原料[2-3].作為第七大營養物質，膳食纖維具有治療糖尿病、預防冠心病、降低血壓、抗癌、治療便秘、清除外源有害物質、降低血清膽固醇等多種功效[4].

本試驗以蕭縣葡萄皮廢棄物為試驗原料，通過酶法對廢棄葡萄皮可溶性膳食纖維進行提取，測定其中的果膠、纖維素、半纖維素、木質素的含量，對可溶性膳食纖維進行紫外光譜和紅外光譜掃描，再進行理化性質(持水性、持油性)測定和抗氧化能力(還原能力、ABTS+清除能力)測定，旨在合理利用葡萄皮廢棄物，為增加其附加價值提供參考.

1 試驗用品

1.1 原料與試劑

赤霞珠葡萄皮(安徽省蕭縣蕭城葡萄酒廠)；纖維素酶、無水乙醇、乙酸銨、甲醇、丙酮、醋酸、三氯乙酸、濃硫酸(上海國藥集團化學試劑有限公司)；氫氧化鈣、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過硫酸鉀、ABTS+(上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

1.2 儀器

可見分光光度計SP-723型(上海光譜儀器有限公司)；傅里葉變換紅外光譜儀Nicolet IS50(賽默飛世爾科技公司)；紫外可見分光光度計HITACHI U-3900H(日本株式會社日立高新技術科學那珂事業所).

2 試驗方法

2.1 原料預處理

從蕭縣蕭城葡萄酒廠收集葡萄皮廢棄物，洗凈后于80 ℃下干燥24 h，粉碎，過80目篩，將得到的粉末進行密封，保存備用.

2.2 膳食纖維組分的測定

2.2.1 果膠的測定

稱取干燥備用的葡萄皮粉末1.000 g，加入15 mL 0.5%乙酸銨溶液，于90 ℃下水浴加熱1.5 h，冷卻過濾.所得殘渣用蒸餾水、甲醇、丙酮依次洗滌，烘干稱重得A1.所得上清液加入4倍體積的無水乙醇，靜置1 h.放入離心機中離心(6 000 r/min，20 min).離心后沉淀放置于75 ℃干燥箱中烘干，稱重得果膠物質B.

2.2.2 半纖維素的測定

在室溫下，向殘渣A1中加入0.25%氫氧化鈣溶液，物料濃度為3.3%， 50 ℃加熱2 h.過濾，向殘渣中依次加入蒸餾水、甲醇、丙酮洗滌.烘干稱重得殘渣A2.過濾所得堿性提取液用醋酸進行中和，加入4倍體積的無水乙醇，靜置1 h后離心.離心所得沉淀經烘干稱重得半纖維素B2.

2.2.3 木質素、纖維素的測定

向殘渣A2中加入15 mL 50%的濃硫酸，于4 ℃冰箱里放置24 h.混合液經抽濾干燥，稱重得A3.后置于馬弗爐中燃燒灰分[6]，測得質量為A4.則木質素含量為A3-A4，纖維素含量為A2-A3-A4.

2.3 酶法提取可溶性膳食纖維

稱取葡萄皮粉末 2.5 g，按料液比1∶20加入蒸餾水，超聲波處理30 min (100 Hz)，向處理后的混合液中加入2.0%的纖維素酶，55 ℃加熱3 h， 100 ℃滅酶處理10 min.滅酶后，將混合液放置于離心機中離心20 min，轉速為8 000 r/min.離心所得殘渣用蒸餾水洗滌至中性得不溶性膳食纖維(IDF).離心所得上清液加熱蒸發至原溶液體積的1/3，加入4倍體積的無水乙醇，靜置1 h.靜置后8 000 r/min離心20 min.沉淀80℃烘干稱重即得可溶性膳食纖維(SDF)[7].

2.4 葡萄皮中可溶性膳食纖維結構初步鑒定

2.4.1 葡萄皮可溶性膳食纖維紫外光譜分析

取干燥的SDF樣品，配制濃度為2 mg/mL的SDF樣品水溶液，以蒸餾水為參比，使用10 mm石英比色皿，在紫外可見分光光度計上于190-700 nm波長處進行掃描，觀察紫外光譜特性.

2.4.2 葡萄皮可溶性膳食纖維傅里葉變換紅外光譜分析

稱取2 mg干燥的SDF樣品，與適量KBr粉末充分混合，在潔凈的瑪瑙研缽中研磨成細粉并混合均勻.取研磨后的樣品用壓片機壓成薄片，置于紅外光譜儀中掃描，掃描范圍4 000-400 cm-1，掃描次數32次，分辨率為8 cm-1[8].

2.5 葡萄皮中可溶性膳食纖維理化性質測定

2.5.1 葡萄皮可溶性膳食纖維的持水性測定

準確稱取0.3 g SDF樣品，加入5 mL蒸餾水震蕩搖勻，于室溫下靜置12 h至溶液達到飽和狀態.放入離心機中以4 000 r/min 離心20 min.除去上清液，用濾紙吸干殘液，稱取產品的濕重.

持水力(g/g)=
(產品濕重-樣品干重)/樣品干重.

2.5.2 葡萄皮可溶性膳食纖維的持油性測定

準確稱取0.3 g SDF樣品，加入10 mL植物油震蕩搖勻，于4℃冰箱中，靜置12 h.于離心機中以4 000 r/min離心處理20 min.除去上清液，并使用吸油紙吸去殘液，稱取樣品濕重[9].

持油力(g/g)=
(樣品被油飽和后濕重-樣品干重)/樣品干重.

2.6 葡萄皮中可溶性膳食纖維抗氧化性測定

2.6.1 鐵氰化鉀還原能力的測定

將提取的可溶性膳食纖維SDF溶于水中，分別配制成1-9 mg/mL濃度梯度的溶液.從不同濃度的溶液中各取1 mL樣品溶液，分別向其中依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS、pH=6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀.充分混合后，于恒溫水浴鍋中50 ℃下加熱20 min.向其中加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，3000 r/min離心10 min.離心后吸取上清液2.5 mL，向其中加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液.充分混合，于700 nm處測定樣品吸光值[10].

2.6.2 ABTS+清除能力的測定

將提取的可溶性膳食纖維SDF溶于水中，分別配制成1-10 mg/mL濃度梯度的溶液.與此同時，將7 mmol/L的ABTS+溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，充分混勻后在常溫下避光反應12-16 h，反應結束用無水乙醇稀釋，使用分光光度計在734 nm波長測定吸光值在0.70±0.02范圍內[11].取不同濃度的葡萄皮渣SDF溶液0.1 mL，向其中加入2.9 mL的乙醇稀釋液，混合均勻.繼續避光反應20 min，在734 nm處測定不同濃度樣品的吸光值，記為A樣品.同時，用蒸餾水替代樣品溶液，重復以上操作，測定吸光度值為A對照.

ABTS+清除率=(1-A樣品/A對照)×100%

3 結果與分析

3.1 膳食纖維組分測定結果

膳食纖維組分測定結果如圖1所示.由圖1可知，各膳食纖維組分含量由大到小為：木質素>果膠>纖維素>半纖維素.其中木質素、纖維素、半纖維素為不溶性膳食纖維組分，果膠和部分半纖維素屬于可溶性膳食纖維.據研究可知，不溶性膳食纖維吸收液體，在消化道膨脹，加快食物在消化道移動，但卻不參加人體的血液和體液循環，不能被大腸中微生物酵解.此外，由于不溶性，使得不溶性膳食纖維在食品行業應用中受到了一定的限制，而可溶性膳食纖維溶于液體，參與人體的血液和體液循環，并能被大腸中微生物酵解，在循環過程中吸附和凈化血液和身體各部器官，是維持健康血糖水平的有效工具，所以可溶性膳食纖維就更加彌足珍貴.通過酶法提取葡萄皮中可溶性膳食纖維，其含量為230.4±28.0 mg/g.

圖1 可溶性膳食纖維各組分含量

3.2 可溶性膳食纖維結構初步鑒定

3.2.1 紫外光譜掃描結果分析

紫外可見吸收光譜又稱電子躍遷光譜，吸收波長范圍200-400 nm，可用于結構鑒定和定量分析.分子或離子吸收紫外或可見光后發生價電子的躍遷，同時又伴隨振動和轉動能級間的躍遷，因此紫外可見光譜呈現寬譜帶.例如，多糖在200 nm處有特征吸收峰，核酸在260 nm處有特征吸收峰，蛋白質在280 nm處有吸收峰，某些色素在600 nm處有吸收峰[12].SDF的紫外光譜如圖2所示，200 nm附近有最大吸收峰，此為多糖的特征吸收峰，表明SDF中含有大量糖類物質.200 nm以下出現的雜峰，可能是SDF樣品溶液中溶解氧分子和水分子造成的雜峰.此外，在280 nm處有弱吸收峰，為蛋白質的特征吸收峰，是由于酶法提取SDF中殘留的纖維素酶.

圖2 SDF紫外光譜

3.2.2 紅外光譜掃描結果分析

SDF的紅外光譜掃描結果分析如圖3.由圖3可知，3 444 cm-1處出現的寬峰是O-H的伸縮振動，由于分子間和分子內氫鍵的形成，此處吸收峰較寬，2 800-3 200 cm-1處是糖類甲基上C-H的收縮振動，1 632 cm-1是羧基COO-的特征峰，該區吸收峰強度較大，說明樣品中含有糖醛酸，1 200-1 400 cm-1區域的吸收峰是糖類的特征吸收峰，是由C-H的變角振動產生的， 1 107 cm-1是表征半纖維素的特征吸收峰，是C-O、C-C、的伸縮振動或是C-O-H的彎曲振動.由于半纖維素是由多種糖基糖醛酸基所組成的復合聚糖，結構不同，其溶解性能也不同[8].

圖3 SDF紅外光譜圖

3.3 持水力和持油力測定結果分析

持水力是在外力作用下，SDF保持水分的能力，所以人體攝入膳食纖維會有飽腹感，從而達到減肥的作用.可溶性膳食纖維化學結構中含有很多親水性基團，如果膠、部分半纖維素，因此具有較強的持水性；持油力的大小由SDF中親脂基團的數量決定，持油力值越高，則SDF吸收食物中油脂能力越強，對人體腸道健康有益.本試驗中SDF持水力和持油力大小如圖4所示，測得持水力為1.25 g/g，持油力為0.67 g/g.

圖4 SDF持水力、持油力測定

3.4 抗氧化性測定結果

3.4.1 鐵氰化鉀還原能力測定結果分析

還原劑是通過自身的還原作用，給出電子而清除自由基，還原能力越強，抗氧化性越強.由圖5中數據可知，不同濃度SDF還原能力不同.隨著SDF濃度的增加，吸光值不斷增加，表示相應還原能力不斷增強[13].SDF濃度為1-6 mg/mL時，還原能力增長趨勢較明顯，此后趨于平緩.

圖5 SDF還原能力測定

3.4.2 ABTS+清除能力測定結果

ABTS+清除能力測定結果如圖6.可以看出，在SDF濃度范圍內，SDF與ABTS+清除能力呈正相關，當質量濃度超過9 mg/mL，ABTS+清除率有下降趨勢，在本研究中，ABTS+清除自由基能力最高達到77.5%，說明可溶性膳食纖維具有較好的自由基清除能力.

圖6 ABTS+清除能力測定曲線

4 結論

本試驗測定了葡萄皮中膳食纖維的組分含量，并使用酶法提取可溶性膳食纖維，對其進行紫外和紅外光譜掃描，研究其理化性質和抗氧化性.通過試驗可得，葡萄皮中可溶性膳食纖維含量為230.4±28.0 mg/g，紫外和紅外光譜掃描結果顯示可溶性膳食纖維中含有大量糖類物質，并測得可溶性膳食纖維持水力為1.25 g/g，持油力為0.67 g/g.此外，不同濃度的SDF還原能力不同，隨著SDF濃度的不斷增加，還原能力不斷增強，最初趨勢較明顯，逐漸趨于平緩.ABTS+清除能力方面，在SDF濃度范圍(1-9 mg/mL)內，SDF與ABTS+清除能力呈正相關，當質量濃度超過9 mg/mL時，ABTS+清除率有下降趨勢.在本研究中，ABTS+清除自由基的能力最高達到77.5%，說明可溶性膳食纖維對自由基有不錯的清除能力.綜上，表明可溶性膳食纖維SDF有很好的應用前景[14].