槲皮素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用

林雪梅 王小林 唐春紅

[摘要]目的探討棚皮素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法將54只雄性SD大鼠隨機分成三組：假手術組、缺血再灌注組、缺血再灌注+棚皮素組。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血模型，缺血2 h，再灌注24 h;假手術組僅暴露左側頸總動脈后縫合。缺血再灌注+棚皮素組大鼠在缺血30 min后腹腔注射棚皮素50 mg/kg，假手術組及缺血再灌注組大鼠按相同方式給予等體積溶劑。再灌注24 h后評價大鼠神經功能狀態、腦組織含水量，觀察腦組織形態學變化，制備腦組織勻漿并測定腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。結果腹腔注射棚皮素后，大鼠神經功能評分降低、腦組織含水量下降、腦組織內SOD活性增加、MDA含量降低、腦組織損害減輕，差異有統計學意義（P<0.05）。結論棚皮素可通過調節抗氧化途徑保護腦缺血再灌注引起的神經損傷。

[關鍵詞]缺血再灌注;抗氧化;槲皮素;神經保護

[中圖分類號]R285.5??? [文獻標識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0024-04

Protective effect of quercetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

LIN Xuemei1，2??? WANG Xiaolin1，2??? TANG Chunhong2

1. Section of Pathology Teaching and Research，North Sichuan Medical College，Sichuan，Nanchong 637000，China;2. Department of Pathology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Sichuan，Nanchong 637000，China

[Abstract]Objective To investigate the protective effect and mechanism of quercetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods A total of 54 male SD rats were randomly divided into 3 groups，which were the sham operation group，the ischemia-reperfusion group，and the ischemia-reperfusion plus quercetin group. The model of focal cerebral ischemia in rats with middle cerebral artery occlusion was made by suture method，and the model was ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h. In the sham operation group，only common carotid artery was exposed and sutured. Rats in the ischemia-reperfusion plus quercetin group were injected with quercetin 50 mg/kg intraperitoneally after ischemia for 30 min，while rats in the sham operation group and the ischemia-reperfusion group were treated with the same volume of solvent in the same way. 24 h after reperfusion，the neurological function and water content of brain tissue were evaluated，the morphological changes of brain tissue were observed，the homogenate of brain tissue was prepared，and the activity of superoxide dismutase （SOD）and the contents of malondialdehyde （MDA）in brain tissue were detected. Results After intraperitoneal injection of quercetin，the neurological function score of rats decreased，the water content of brain tissue descended，the activity of SOD in brain tissue increased，the content of MDA decreased and the damage of brain tissue alleviated，with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Quercetin can protect neurological injury caused by cerebral ischemia-reperfusion by regulating antioxidant pathway.

[Key words]Ischemia-reperfusion;Antioxidant;Quercetin;Neuroprotection

缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是指器官血流減少或中斷，隨后血流再灌注及細胞復氧，從而引起組織細胞損傷[1-2]，這一損傷過程涉及氧自由基的生成[3]、鈣離子內流[4]、補體激活[5]、toll樣受體激活和炎癥反應[6-9]等多種復雜機制。槲皮素作為一種強自由基清除劑[10]，不斷地被用于全身各器官缺血再灌注損傷模型保護性研究，包括心、肝、腎、睪丸、骨骼肌等[11]。實驗數據表明槲皮素可通過多種途徑發揮腦缺血再灌注損傷保護作用，包括激活凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑抑制神經細胞凋亡[12]、減少白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥遞質抑制炎癥反應[13]、下調基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP-9）維持血腦屏障完整性[14]及以提高腦組織內硫氧還蛋白含量發揮抗氧化應激[15]等。雖然槲皮素已經被運用于腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究，但相關治療臨床前研究指南指出，在腦缺血性損傷的藥物研究中應選擇多重指標[16]。故本研究采用局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察槲皮素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。

1??? 材料與方法

1.1??? 實驗動物和主要試劑

雄性SD大鼠由川北醫學院實驗動物中心提供，重量為250～300 g。槲皮素購自美國Sigma-Aldrich，純度≥98%。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司。

1.2??? 藥物和實驗動物的準備

雄性SD大鼠54只，隨機分成三組：假手術組、缺血再灌注組、缺血再灌注+槲皮素組，每組各18只。將槲皮素溶解于二甲基亞砜，配制藥物濃度50 mg/ml備用。按50 mg/kg劑量在缺血30 min后經腹腔注射給予缺血再灌注+槲皮素組大鼠藥物，假手術組和缺血再灌注組則按相同方式給予等體積溶劑。

1.3??? 動物模型的制備

用線栓法制備動物模型。用石蠟包裹、頭端呈梭形的0.24 mm魚線做線栓。術前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射0.35%水合氯醛麻醉（0.1 ml/kg）大鼠，暴露左側頸總動脈，在頸總動脈壁剪一破口，線栓經破口插入頸內動脈，過頸動脈分叉處繼續進線約2 cm時稍感阻力，提示線栓已經到達左側大腦中動脈并阻斷大鼠左側大腦中動脈血流，造成大鼠左側腦組織缺血性損傷。隨即將線栓固定在頸總動脈，縫合傷口。栓塞缺血2 h后退出線栓再灌注24 h。假手術組大鼠僅暴露左側頸總動脈后縫合。

1.4??? 神經功能評分

再灌注24 h后，根據Zea-longa評分標準[15]觀察大鼠行為學變化并評分：無神經缺損癥狀為0分;不能伸展右側前爪為1分;行走時向右側轉圈為2分;行走時向右側傾倒為3分;不能自發行走，意識喪失為4分。1～3分為有效模型。

1.5??? 腦組織含水量測定

每組6只，大鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，去除腦表面的硬脊膜、小腦及腦干部分，立即用微量精密天平稱取大腦組織重量，然后放入烘箱，80℃烘72 h至恒重，稱取干重。腦含水量=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%。

1.6??? 大鼠腦皮質形態學觀察

每組6只，大鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，10%福爾馬林溶液固定24 h，取材、固定、脫水、包埋、3 μm切片后行蘇木素-尹紅染色。

1.7??? 腦組織內SOD活性及MDA含量測定

每組6只，大鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，剪取少量顏色晦暗、腫脹區域（即梗死區）腦組織稱重，然后置于勻漿器中進行手工勻漿，制備10%腦組織勻漿，2000 r/min離心15 min，取其上清液，參照南京建成生物技術有限公司試劑盒操作說明檢測腦組織勻漿中SOD活性及MDA含量。

1.8??? 統計學處理

2??? 結果

2.1??? 槲皮素對各組大鼠神經功能評分及腦組織含水量的影響

與缺血再灌注組比較，腹腔注射50 mg/kg槲皮素能顯著降低大鼠神經功能評分及腦含水量，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2??? 槲皮素對各組大鼠腦組織SOD活性及MDA含量的影響

與缺血再灌注組比較，腹腔注射50 mg/kg槲皮素能顯著提高腦組織內SOD活性及降低MDA含量，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.3??? 槲皮素對各組大鼠腦皮質形態學改變的影響

假手術組大鼠腦皮質細胞排列整齊、形態結構正常、組織間質均勻紅染無異常。缺血再灌注組大鼠腦皮質細胞數量減少、排列紊亂、可見核固縮及細胞水腫、組織間質內網狀結構疏松淡染、并見小空泡。與缺血再灌注組比較，腹腔注射50 mg/kg槲皮素后，大鼠腦皮質細胞數量增多、密度增加，發生核固縮和水腫的細胞數量均減少，組織間質水腫程度減輕。見圖1。

3??? 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于各種蔬菜水果中，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗感染、抗腫瘤、擴張血管、治療代謝性和心血管疾病等多種藥用價值[17]。研究表明其對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，但根據相關治療臨床前研究指南，在腦缺血性損傷的藥物研究中除了選擇多重指標外，其評價應包括組織和行為學結果[16]。發生腦缺血再灌注時，血管通透性增強，血管源性腦水腫形成;隨著細胞復氧，線粒體功能受損，活性氧生成增加，從而誘導一系列氧化應激反應，導致細胞水腫、凋亡甚至梗死[18]，故而動物可出現一系列異常的神經行為學表現。因此，本研究量化統計大鼠神經功能評分、評價腦組織含水量、觀察腦組織形態學變化，可以反映大鼠腦缺血再灌注的損傷程度。

與缺血再灌注組比較，腹腔注射槲皮素后，大鼠神經功能評分和腦組織含水量均明顯下降。提示槲皮素能改善腦缺血再灌注損傷引起的神經功能損害及腦水腫。此外，發生腦缺血再灌注損傷后，腦組織損傷體現為細胞數量減少、核固縮、細胞水腫，腦組織間質內網狀結構疏松淡染及小空泡形成。而腹腔注射槲皮素后，腦皮質細胞數量增多、密度增加、核固縮和水腫細胞數量均減少，腦組織間質水腫程度減輕，這些形態學改變與大鼠的神經功能評分及腦組織含水量改變趨勢是一致的，提示槲皮素可減輕腦缺血再灌注損傷引起的損傷。

腦缺血再灌注損傷機制復雜，其中內源性抗氧化因子減少、氧自由基增加以及隨后的氧化應激被認為在缺血再灌注中起著關鍵作用。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物，包括MDA、酮基、羥基等。因此，MDA含量高低可反映脂質過氧化程度。而SOD可通過歧化反應清除體內生成的氧自由基、阻斷脂質過氧化連鎖反應，保護細胞免受損傷[19]，其活性高低可反映機體清除氧自由基的能力。與缺血再灌注組比較，本研究結果提示，槲皮素能顯著提高SOD活性、降低MDA含量，提示槲皮素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護機制可能與其抗氧化特性有關。

綜上所述，槲皮素可改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后引起的神經功能損害，減輕腦水腫及腦組織損害程度，提高內源性抗氧化酶活性，降低脂質過氧化反應，從而發揮神經保護作用。

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