柚皮素對牙本質基質金屬蛋白酶活性及粘接耐久性的影響

張文浩 葉琦 魏迪欣 莊園 李艷芬

[摘要]目的探討柚皮素對牙本質基質金屬蛋白酶活性及粘接耐久性的影響。方法收集2019年1月至2020年6月就診于深圳市寶安區婦幼保健院口腔科患者的第三磨牙進行研究，第三磨牙由深圳市寶安區婦幼保健院口腔科提供。將第三磨牙制備成牙本質試件及牙本質粉，隨機分為去離子水處理組（空白對照組）、柚皮素處理組、氯己定處理組。各組分別處理10 mm，將牙本質膠原樣本分別置于老化液中15 d，檢測柚皮素對膠原干重、羥脯氨酸釋放量、MMPs活性的影響。制作牙本質剪切力測試試件，分別用柚皮素、氯己定、去離子水處理后，檢測不同組的抗剪切強度。結果柚皮素和氯己定處理后的牙本質膠原的干重丟失比例低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;而柚皮素組與氯己定組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。柚皮素組和氯己定組中羥脯氨酸釋放量低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;而柚皮素組與氯己定組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。柚皮素組及氯己定組的MMPs總活性均低于空白對照組，經氯己定和去離子水處理的活性值比較，差異有統計學意義（P<0.05）。柚皮素和氯己定處理后的最大抗剪切強度高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;且柚皮素處理后的最大抗剪切強度顯著高于氯己定組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論柚皮素能夠抑制基質金屬蛋白酶活性，減少膠原纖維的降解，穩定膠原纖維，從而提高牙本質粘接耐久性。

[關鍵詞]柚皮素;基質金屬蛋白酶活性;粘接耐久性;抗剪切強度

[中圖分類號]R783.1??? [文獻標識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0031-04

Effect of naringenin on matrix metalloproteinase activity and bonding durability of dentin

ZHANG Wenhao??? YE Qi??? WEI Dixin??? ZHUANG Yuan??? LI Yanfen

Department of Stomatology，Shenzhen Baoan Maternal and Child Health-Care Hospital，Guangdong，Shenzhen，518101，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of naringenin on the activity of matrix metalloproteinase and the bonding durability of dentin. Methods The third molars of patients who visited the Department of Stomatology in Shenzhen Baoan Maternal and Child Health-Care Hospital from January 2019 to June 2020 were collected and studied. The third molars were provided by the Department of Stomatology in this hospital. The third molars were prepared into dentin samples and dentin powder，which were randomly divided into deionized water treatment group （blank control group），naringenin treatment group and chlorhexidine treatment group. Each group was treated for 10 minutes，and the dentin collagen samples were placed in aging solution for 15 days. The effects of naringenin on dry weight of collagen，hydroxyproline release and MMPs activity were detected. The test specimens were made for dentin shear and treated with naringenin，chlorhexidine and deionized water，respectively，and then the shear strength of different groups was tested. Results The dry weight loss ratio of dentin collagen treated with naringenin and chlorhexidine was lower than that of the blank group，with statistically significant difference （P<0.05）. However，there was no significant difference between naringenin group and chlorhexidine group （P>0.05）. The release of hydroxyproline in naringenin group and chlorhexidine group was lower than that in blank control group，with statistically significant difference （P<0.05）. However，there was no significant difference between naringenin group and chlorhexidine group （P>0.05）. The total activity of MMPs in naringenin group and chlorhexidine group was lower than that in blank control group，with statistically significant difference （P<0.05）. The maximum shear strength of naringenin and chlorhexidine group was higher than that of the blank group，with statistically significant difference （P<0.05）. The maximum shear strength after treatment of naringenin was significantly higher than that of chlorhexidine group，with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion Naringenin can inhibit the activity of matrix metalloproteinases，reduce the degradation of collagen fibers and stabilize collagen fibers，thus improving the durability of dentin bonding.

[Key words] Naringenin;Matrix metalloproteinase activity;Bonding durability;Shear strength

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組能夠分解細胞外基質的鈣鋅離子依賴型蛋白酶總稱，其在腫瘤轉移中發揮著重要的作用，是目前被廣泛研究的膠原酶之一。牙本質粘接主要是通過酸蝕劑或自酸蝕粘接的處理劑，使粘接界面牙本質脫礦，膠原纖維暴露，隨后親水性樹脂粘接劑滲入膠原纖維網，形成微機械扣鎖作用，連接牙本質和樹脂。然而目前牙本質粘接劑的單體均無法完全滲入至膠原纖維底部，而牙本質粘接劑的酸性環境又能夠將MMP酶原激活，從而分解暴露的膠原纖維，對粘接界面產生破壞，導致粘接失敗，降低牙本質粘接耐久性。因此抑制MMPs的活性能夠有效的增加牙本質粘接耐久性[1]。研究顯示，使用柑橘黃烷酮類物質能夠改善牙本質粘接穩定性，提高牙本質粘接耐久性[2]。柚皮素具有抗炎、抗氧化等多種生物活性，但目前臨床上鮮有柚皮素是否可以抑制膠原酶活性的相關報道。因此，本研究分析了柚皮素對牙本質MMPs酶活性及粘接耐久性的影響。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料和儀器

柚皮素（Sigma，美國）;MMPs活性比色法檢測試劑盒（上海杰美基因）;明膠酶/膠原酶試劑盒（In-vitrogen，美國）;羥脯氨酸試劑（南京建成生物科技公司）;微量加樣器（Eppendof，德國）;多功能酶標儀（Molecular Devices，美國）;慢速金剛石切割機（Buehler，美國）;分析天平（Mettler Toledo，瑞士）;恒溫水浴箱（Shellab，美國）;萬能材料測試儀（Shimadzu，日本）。

1.2??? 方法

1.2.1??? 牙本質的膠原樣本制備??? 收集2019年1月至2020年6月就診于深圳市寶安區婦幼保健院口腔科患者36顆第三磨牙進行研究，第三磨牙由深圳市寶安區婦幼保健院口腔科提供。將牙齒表面的污垢和軟組織進行清除，流水沖洗后去除咬合面釉質，充分暴露冠中部牙本質，制備成牙本質試件，尺寸為7 mm×1.7 mm×0.7 mm，共24個;用100 g/L的HPO進行脫礦，時間為24 h，流水沖洗，檢測牙本質試件的完全脫礦情況。

1.2.2??? 牙本質的膠原干重檢測??? 將牙本質膠原樣本置于離心管中，于真空干燥箱中脫水24 h，達至恒重后對樣本進行稱重并記錄，再浸于去離子水中，隨機分組為空白組（n=12）：將牙本質膠原樣本放置在去離子水中約10 min;柚皮素組（n=12）：將牙本質膠原樣本放置在500 μg/ml柚皮素中處理約10 min;氯己定組（n=12）：將牙本質膠原樣本放置在2 g/L的氯己定液中處理約10 min。將各組牙本質膠原樣本放置在含有1 ml老化液的離心管中，于37℃的恒溫水浴箱中進行老化，15 d后進行再次離心稱重。

1.2.3??? 羥脯氨酸釋放量檢測??? 將老化15 d的牙本質膠原樣本取出，將離心管置于離心機中進行離心，轉速為3000 rpm，時間為30 min;離心完成后收集上清液，利用酶標儀檢測羥脯氨酸的含量，波長設置為550 nm，每個樣本檢測3次，計算牙本質膠原的羥脯氨酸釋放量。

1.2.4??? 基質金屬蛋白酶的提取??? 3種處理組樣本在液氮下碾磨成牙本質粉，分別將1 g牙本質粉加入至10 ml 10%的磷酸中，置于4℃冰箱中進行脫礦，時間為8 h，再置于超低溫離心機中進行離心，轉速為3000 rpm，時間為2 min，棄掉酸蝕液，用5 ml 100mM Tris-HCl對離心管中剩余的牙本質粉進行沖洗，再置于離心機中進行離心，棄掉上清液，重復以上操作3次，加入5 ml十二烷基硫酸鈉溶液，放置在離心機中離心，轉速為14 000 rpm，時間為10 min，提取的上清液為基質金屬蛋白酶。

1.2.5??? 酶活性檢測??? 用MMPs活性比色法檢測試劑盒檢測牙本質提取液中的每10 μg總蛋白中的MMPs總活性。

1.2.6??? 剪切試驗??? 環氧樹脂包埋離體牙，去除牙釉質，暴露冠中部牙本質。用600目的砂紙濕潤下打磨成平面。粘接面的處理分別是：柚皮素組用500 μg/ml的柚皮素中處理約1 min;氯己定組用2 g/L的氯己定中處理1 min;空白對照組用去離子水處理1 min。然后按照標準樹脂粘接、充填流程，完成樣本與復合樹脂的粘接。將試件浸泡于37℃蒸餾水中，放置24 h。以0.5 mm/min進行加載，記錄界面斷裂時的最大剪切力。抗剪切強度（MPa）=最大剪切力值（N）/試件粘結面積（mm）。

1.3??? 觀察指標

記錄柚皮素對膠原干重、羥脯氨酸釋放量、MMPs活性及抗剪切強度的影響。

1.4??? 統計學處理

2??? 結果

2.1??? 不同處理組的牙本質膠原干重丟失比較

柚皮素組干重丟失比例為[1（8.33%）]，氯己定組干重丟失比例為[1（8.33%）]，空白組干重丟失比例為[6（50.00%）]。柚皮素和氯己定處理后的牙本質膠原的干重丟失比例低于空白組，差異有統計學意義（χ=5.040，P=0.025;χ=5.040，P=0.025）;而柚皮素組與氯己定組比較，差異無統計學意義（χ=0.000，P=1.000）。

2.2??? 不同處理組牙本質膠原羥脯氨酸釋放量比較

空白組羥脯氨酸釋放量為（11.51±1.36）μg、柚皮素組羥脯氨酸釋放量為（5.51±0.49）μg、氯己定組羥脯氨酸釋放量為（6.77±0.77）μg，差異有統計學意義（F=0.151，P=0.005）。

2.3??? 不同處理組的牙本質粉MMPs總活性比較

經柚皮素處理的MMPs總活性值是（0.87±0.01）pmoles/（min·mg）;經氯己定和去離子水處理的MMPs總活性值分別是（1.05±0.04）和（1.67±0.13）pmoles/（min·mg），差異有統計學意義（F=7.091，P=0.000）。

2.4??? 不同處理組的抗剪切強度比較

柚皮素處理組獲得最大抗剪切強度為（22.91±3.53）MPa，氯己定處理組獲得最大抗剪切強度為（17.26±3.18）MPa，去離子水處理組獲得最大抗剪切強度為（11.51±1.04）MPa，差異有統計學意義（F=3.923，P=0.000）。見表1。

3??? 討論

MMPs是一種牙本質中常見的內源性蛋白酶。大量研究證實，MMPs參與許多疾病的生理過程和病理過程，常見的口腔疾病為牙周病及牙本質齲等[3-4]。人牙本質中通常含有多種MMPs，牙本質經過礦化后，MMPs以酶原形式包裹在牙本質的基質中[5]。在粘接時使用的酸蝕劑和粘結劑中的酸性單體均能夠分泌出酸性物質，降低口腔內環境的pH值，激活內源性MMPs，以達到降解膠原的效果[6-9]。膠原酶抑制劑通過抑制MMPs活性可提高牙本質的粘結持久性[10-12]。目前常用的膠原酶抑制劑有原花青素及柚皮素，原花青素有助于改善牙本質的粘結持久性，但由于顏色較深，會使牙齒著色，因此在應用中受到限制[13-15]。柚皮素的顏色與人牙齒顏色相近，可有效避免牙齒著色問題[16-17]。柚皮素具有抗菌、抗炎、抗衰老及類雌激素等多種藥理活性，其可通過抑制MMPs活性提高了牙本質的粘接持久性[18]。

本研究結果顯示，柚皮素處理后的牙本質膠原的干重丟失比例、羥脯氨酸釋放量低于氯己定和空白對照組（P<0.05），柚皮素組的MMPs總活性均低于氯己定組、空白對照組（P<0.05）。柚皮素處理后的最大抗剪切強度顯著高于氯己定組、空白對照組（P<0.05）。分析原因可能為：①柚皮素分子結構中的苯環上的羥基等與膠原酶催化區域中的羧基發生化學反應后，改變膠原酶催化區域的空間結構，區域被外源性酶切斷后，MMPs酶原被激活，從而抑制MMPs活性[19-20]。②柚皮素的酚羥基及苯環可能與膠原分子上的酶切割位點發生疏水及氫鍵作用，改變了膠原和酶結合區域的空間構象，導致該位點不容易被膠原酶識別與結合，膠原耐酶解性能增強，從而保護了膠原[21-22]。③柚皮素通過抑制牙本質中MMPs活性，且柚皮素能夠抑制牙髓細胞中的MMPs活性，通過雙重效果來提高牙本質的粘接效果，提高牙本質粘接即刻的微拉伸強度，有利于改善牙本質的粘接耐久性[23]。

綜上所述，柚皮素可通過抑制牙本質的MMPs活性，保護膠原纖維穩定，增加牙本質的抗剪切強度以改善牙本質的粘接耐久性。

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