多糖組合物對特應性皮炎的功效評價及機理研究

楊凱業 陳俊松 劉光榮 林麗 韓萍 馬詩經 譚譯楷 吳顯儀 張藍月 杜志云

本研究通過DNFB模擬的特應性皮炎（AD）模型，基于南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖良好的免疫調節以及抗炎功效，將5種多糖配方組合制備成5種天然多糖組合物，研究該多糖組合物的抗炎、抗氧化、免疫調節等機制，探索利用天然多糖緩解AD的作用及機理。

關鍵詞：天然多糖組合物;特應性皮炎;抗炎

皮膚是保護人體免受外界傷害與刺激的重要保護層，當外界刺激給人體造成損傷時，皮膚的免疫系統會啟動信號，促進炎癥因子（如白介素等）以及組胺過度表達[2]，引起血流加快、細胞的通透性增加，導致皮膚出現緊繃和發紅、瘙癢、脫屑甚至燒灼和刺痛等癥狀[3]。

特應性皮炎（atopicdermatitis，AD）是以慢性、炎癥性、瘙癢性為主要表現的皮膚病。過去30年，AD患病率在全球范圍內逐步上升，歐美國家兒童患病率為7%～30%，成人1%～10%。我國2015年一項流行病學調查顯示，1～7歲兒童AD患病率為12.94%，而成人AD的患病率尚無大樣本流行病學調查數據[1]。

臨床上對于AD治療主要應用糖皮質激素類外用藥物進行，但是長期應用激素類外用藥物會導致皮膚出現萎縮、色素沉著以及毛細血管擴張等不良現象[6-8]，進一步對皮膚加以損害。

2，4-二硝基氟苯（DNFB）模擬的AD模型，可通過破壞皮膚的屏障功能達到表皮厚度增加和表皮出現紅斑等癥狀來模擬AD癥狀[4-5]。本研究通過DNFB模擬的AD模型，基于南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖良好的免疫調節以及抗炎功效，將5種多糖配方組合制備成5種天然多糖組合物，研究該多糖組合物的抗炎、抗氧化、免疫調節等機制，探索利用天然多糖緩解AD的作用及機理。

沙參在歷代本草中都有記載，《本草從新》首次把沙參分為南沙參和北沙參。南沙參性甘，微寒;歸肺、胃經;有養陰清肺，化痰，益氣等功效，用于肺熱燥咳，陰虛勞嗽，干咳痰黏，氣陰不足，燥熱口干。枸杞子始載于《神農本草經》，被列為上品。《本草綱目》對枸杞子的功效記載頗為詳細，可補腎生精，養肝，明目，堅筋骨，去疲勞，易顏色，明目安神，令人長壽[9]。云芝隸屬真菌門擔子菌亞門多孔菌科栓菌屬，具有增強免疫、抗氧化等功效[10]。玫瑰在《藥性考》中有記載，可行血破積，損傷瘀痛，浸酒飲。黃芩是中醫臨床常用藥材，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛之功效[11]。

南沙參多糖能夠對血清抗體的水平產生顯著的提高作用，從而對免疫有一定的調節作用[12];枸杞多糖作為枸杞子中主要化學成分及活性成分，具有多種生物活性，有很好的消炎止痛作用，且不良反應小、藥物依賴性弱[13];云芝多糖能提高機體免疫功能，增強機體抗感染能力，對自身免疫性疾病、感染性疾病的治療有重要意義[14];玫瑰多糖可以增強鼠巨噬細胞的白細胞介素6的產生，具有有效的免疫調節活性[15-16]。

01材料與方法

1.1主要材料、試劑、儀器與試驗動物

丙二醇（≥99.9%），華韻生物;九水合硫化鈉（≥99.9%），阿法埃莎;生理鹽水（0.9%），廣州美侖生物科技有限公司;無水乙醇，廣州化學試劑廠;多聚甲醛（4%），阿拉丁;橄欖油（酸度≤0.3%），黛尼;DNFB（98%），麥克林;蒸餾水，實驗室自制。

超高壓均質機JN-02HC，廣州聚能納米有限公司;電熱恒溫水浴鍋DK-S22，上海精宏試驗設備有限公司;離心機Z326K，德國賀默公司;數控超聲波清洗器KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2天然多糖的制備、篩選及多糖組合物的復配

1.2.1天然多糖的提取

參考王淑萍等的實驗方法[17]，取曬干之后的南沙參，粉碎后取20g，與200mL體積分數為95%的乙醇溶液混合，密閉靜置過夜。后過濾加入150mL純化水，置于90℃恒溫水浴鍋恒溫加熱3h，用300目濾袋過濾得懸濁液，靜置2h后，將懸濁液用雙層中速定性離心紙過濾，得到植物多糖水溶液，烘干得到植物多糖提取物。枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖、黃芩多糖的提取方法與南沙參多糖提取方法相同，均為水提醇沉法提取。

1.2.2天然多糖的含量測定

移取一定量植物多糖水溶液至100mL容量瓶，用純化水定容至刻度線，移取2mL該溶液至試管，再各加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，然后加入5.0mL濃H2SO4使其充分混勻，置于沸水浴中加熱15min，取出后在冰浴中冷卻至室溫。取100μL溶液于96孔板中，在酶標儀中在490nm處對樣品測定吸光值。將吸光度與多糖標準曲線對比，得出該溶液多糖含量。

1.2.3天然多糖組合物復配

多糖組合物包括復配1～5：枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖組合形成復配1;黃芩多糖、南沙參多糖、云芝多糖組合形成復配2;南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖組合形成復配3;黃芩多糖、云芝多糖、玫瑰多糖組合形成復配4;黃芩多糖、枸杞多糖、南沙參多糖組合形成復配5。以上5種復配的多糖質量濃度均為0.5%（w/v）。

1.3AD動物模型及給藥方法

參考MotoyamaK等的實驗方法[18]，取BALB/c雄性小鼠70只，4周齡，體重20～25g，購自廣東省醫學試驗動物中心【動物批號：SCXK（粵）2016-0041】。小鼠標準環境飼養，室溫維持在（24±0.2）℃，保持晝夜12h節律，自由飲水、攝食。適應性飼養1周后進行實驗。小鼠隨機分為空白組、模型組、復配1、2、3、4、5組（共7組，每組10只）。實驗前一周剔除小鼠背部毛發（面積約2cm×4cm），直至皮膚完全顯露。脫毛次日，除空白組外，其余各組用0.5%DNFB涂抹小鼠背部脫毛皮膚，每只100μL，連續涂抹7d。造模第7天，模型穩定，各給藥組開始給予相應的受試物，連續給藥15d。給藥期間，除正常組外，其余各組每周3次動物背部及右耳涂抹0.2%DNFB，其中背部100μL，右耳50μL。各治療組從造模第7天開始外用涂抹給藥，1次/d，連續15d，將受試物少量涂于患病右耳及背部皮膚，模型組及空白組不涂抹。

1.4PASI評分

觀察各組小鼠每天的背部皮損變化情況，依據PASI評分標準給予小鼠皮損處紅斑（erythema）、鱗屑（scales）和浸潤增厚程度（thickness）0～4的積分：0，無;1，輕度;2，中度;3，重度;4，極重度。將三者積分相加得到總積分（0～12），對各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢線。

1.5H&E染色

將耳部及背部皮膚組織用4%多聚甲醛固定，常規脫水后，石蠟包埋。將修整好的蠟塊放置在石蠟切片機上切成厚度為4μm的切片。切片漂浮于攤片機40℃溫水上，將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃烘箱內烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存備用。切片于顯微鏡下觀察并隨機選取視野進行拍照并測量其厚度。

1.6甲苯胺藍染色測定皮膚肥大細胞密度

用于實驗的石蠟切片的皮膚組織用曲別針反貼固定在硬質塑料卡上，防止組織固定時卷曲。經10%福爾馬林固定后，進行石蠟包埋和常規切片，甲苯胺藍染色法對小鼠皮膚組織石蠟切片進行染色，觀察各組小鼠患部皮膚組織中肥大細胞數量變化。使用ImageJ1.48軟件在放大倍率200×下進行肥大細胞計數。

1.7實時熒光定量PCR檢測

將受試小鼠處死后剪去受試小鼠背部皮膚約1cm×1cm的面積（>100mg）的全層皮膚組織。檢測皮膚組織中IL-6mRNA、MCP-1mRNA、cAMPmRNA表達。使用總RNA提取試劑盒，從小鼠皮膚組織中提取mRNA，測定RNA含量、純度符合要求。使用反轉錄試劑盒合成cDNA。以GADPH作為內參基因，根據2-ΔΔCt算法進行各組mRNA表達量檢測。引物由廣州賽維爾生物科技有限公司合成，總RNA提取試劑盒購自賽維爾，貨號：G3013。引物序列見表1。

1.8統計學處理

實驗結果采用單因素方差分析，采用GraphPad軟件作圖。使用ImageJ軟件處理甲苯胺藍染色圖片，所有數值均用“均數±標準誤差”。各組間差異比較用單因素方差分析（One-WayANOVA），進行組間兩兩多重比較。

02結果

2.1多糖提取及含量測定結果

5種植物提取的多糖如表2所示，其中枸杞多糖固重達到8.44g，多糖含量達到43.85%;黃芩多糖固重達到7.10g，多糖含量達到35.50%。

2.2DNFB模型小鼠背部皮膚PASI評分

與空白組比較，模型組小試背部皮膚出現紅、腫等癥狀;與模型組比較，各多糖復配組紅、腫等癥狀明顯好轉;其PASI評分如圖所示。各多糖復配組的第17天PASI評分均明顯低于模型組。

2.3DNFB模型小鼠背部皮膚厚度測量及統計

通過對小鼠背部皮膚HE染色，測量其背部皮膚厚度，結果如圖2所示。與空白組比較，模型組小鼠背部表皮厚度增厚;與模型組比較，各多糖復配組的小鼠背部表皮厚度均顯著下降，其中復配3組的小鼠背部表皮厚度接近空白組。

2.4DNFB模型小鼠耳部皮膚厚度測量及統計

通過對小鼠耳部皮膚HE染色，測量其耳部皮膚厚度，結果如圖3所示，圖3A中刺激為涂抹了98%DNFB的小鼠右耳，未刺激為沒有涂抹98%DNFB的小鼠左耳。涂抹了98%DNFB的模型組小鼠與空白組比較，模型組小鼠耳部表皮厚度增厚;與模型組比較，各多糖復配組的小鼠耳部表皮厚度均顯著下降，其中復配1、復配4組的小鼠耳部表皮厚度接近空白組。

2.5各天然多糖組合物復配對小鼠背部炎癥皮膚組織中肥大細胞密度抑制情況

與空白組比較，模型組肥大細胞密度顯著升高;與模型組比較，各多糖復配組肥大細胞密度均顯著降低，見圖4。

2.6CAMP、MCP-1、IL-6在mRNA中的表達量

實時熒光定量PCR結果表明，與模型組相比，給予多糖復配1的小鼠背部全層皮膚組織中CAMPmRNA的表達量顯著升高，如圖5所示。

與空白組比較，模型組小鼠背部全層皮膚組織中MCP-1mRNA的表達量顯著升高。與模型組相比，給予多糖復配1、3、4、5組的小鼠背部全層皮膚組織中MCP-1mRNA的表達量明顯降低，給予多糖復配2、4組的小鼠背部全層皮膚組織中IL-6mRNA的表達量明顯降低。

03討論

患AD后，皮膚免疫屏障受損，導致免疫調節下降，體內肥大細胞活化，炎癥反應增強[19-22]。肥大細胞是炎癥的主要啟動細胞，發生炎癥反應時，肥大細胞向外周組織過度浸潤加劇、放大炎癥反應[23-24]。

有研究表明，AD患者外周血中肥大細胞的數量增多。

AD慢性期，免疫屏障受損，白介素-6等Th1型細胞因子和趨化因子表達水平提高，Th2細胞因子蛋白表達受抑制，刺激肥大細胞、巨噬細胞等炎癥細胞增多[25-28]。但同時，患AD后，巨噬細胞的遷移過程受阻，吞噬作用降低，導致無法抵御污染源，MCP-1在巨噬細胞的遷移過程中起到至關重要的作用。研究表明，cAMP參與了多種重要炎癥信號通路的調控，如MAPKs、NF-κB、JAKSTAT等通路。

本研究通過DNFB誘導小鼠成功模擬AD模型。結果表明，通過給予多糖復配的小鼠皮膚狀況顯著好轉，明顯抑制了小鼠耳部及背部紅、腫等癥狀。

從組織學結果可以看出，南沙參多糖、枸杞多糖、玫瑰多糖、云芝多糖以及黃芩多糖組合物通過調節提升小鼠體內Th1/Th2平衡，從而抑制了肥大細胞的活化，降低肥大細胞密度。實時熒光定量PCR檢測結果表明，多糖組合物提升了cAMP在mRNA中的表達水平，同時調節MAPKs、NF-κB通路中MCP-1的表達，增強了皮膚角質層屏障功能，修復了受損細胞。同時，多糖組合物通過抑制白介素-6在mRNA的表達量，使機體Th1/Th2平衡得以調節以及巨噬細胞的活化，從而有效緩解了AD的癥狀。