地黃飲子對腎虛血瘀證帕金森病α-synuclein表達的影響*

趙嘉琳 竇志芳 趙 瓊

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)又名震顫麻痹(Paralysis agitans),作為臨床常見的中樞神經系統退行性疾病,癥狀多見運動障礙、靜止性震顫、姿勢平衡障礙等[1]。本病發病年齡多集中于60歲及以上[2]，中國65歲以上患病率約達1.7%，由于社會老齡化問題日趨嚴重，患病率仍有提升[3]。臨床治療中PD多使用左旋多巴為主要成分的藥物制劑，但局限于對癥治療,且長期使用該類藥物患者易產生不良作用[4]。地黃飲子臨床用以治療下元虛衰、陰陽俱虛的喑痱證，組方藥物有熟地黃、山萸肉、肉蓯蓉等，具有腎陰陽雙補的功效。國家名老中醫韓明向教授，在治療PD的臨床用藥中以地黃飲子方為基礎，以滋補肝腎作為主要治療方向，并辨證論治效如桴鼓[5]，伍愛國[6]在黃煌教授“方人”理論指導下，明確指出，臨床中地黃飲子用藥后可明顯改善精神情態，長期堅持可改善行走質量。腎為先天之本，虛則氣滯，氣停則血瘀。多研究表明[7]PD不同證候均可伴有瘀血的存在。趙冠英和楊明會教授認為，腎虛血瘀為PD的基本病機，補腎活血法臨床治療屢獲奇效[8]。已有實驗證明，丹皮酚作為牡丹皮的活性成分，能夠對PD模型細胞損傷進行保護[9]。因此，此研究以“腎腦相關”“腎虛血瘀”為理論指導，使用長期低劑量腹腔注射D-半乳糖結合頸背部皮下注射魚藤酮溶液復合式方法制備PD病證結合模型，選用地黃飲子加活血化瘀藥牡丹皮進行干預，研究地黃飲子加減方對PD大鼠黑質紋狀體內α-syn的影響，探討地黃飲子加減方對腎虛血瘀證PD大鼠治療中的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠80只，體質量(230±20)g，6個月齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號：SCXF(京)2018-0003)。將實驗動物飼養于山西省中醫藥大學實驗動物房，自由飲食，自然光源，室溫(25±2)℃。為保證大鼠存活率，進行適應性喂養1周。

1.2 主要試劑D-半乳糖(北京索萊寶科技有限公司，D8310-100 g)，魚藤酮(羅恩，R006873)，DMSO(Solarbio,D8370-100 g)，α-synuclein 抗體(武漢三鷹，66412-1-Ig)，HPR標記山羊抗小鼠二抗(武漢賽維爾，G1216-3)，高脂飼料(特洛菲飼料科技有限公司)，地黃飲子加減方(熟地黃、巴戟天、山萸肉、石斛、肉蓯蓉、炮附片、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠志、薄荷、牡丹皮)購置于北京同仁堂，經山西中醫藥大學趙瓊副教授鑒定為正品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組將80只大鼠據Rand函數，隨機分為PDZC組、PDJB組、SXYY組、DHYZ組,每組20只。PDZC組喂養基礎飼料，其余各組大鼠喂養高脂飼料。

1.3.2 病癥結合PD大鼠模型建立PD模型構建：除PDZC組大鼠，余下組行頸背部皮下注射魚藤酮法造PD模型[11]。每日早9：00，在PDJB、SXXY、DHYZ組大鼠頸背部皮下注射濃度為1.0 mg/(kg·d)的魚藤酮溶液(DMSO為溶劑：1.5 mg/ml)。前3周注射1/2正常水平的魚藤酮溶液，以降低大鼠病死率。3周后恢復正常水平注射。每周休息1 d。PDZC組用同樣方法注入等體積生理鹽水。腎虛血瘀證模型構建：SXYY、DHYZ組大鼠連續腹腔注射D-gal溶液(D-gal粉末50 mg/(kg·d)溶于0.9%生理鹽水)6周。其余各組大鼠用同樣方法注入等體積生理鹽水。

1.3.3 藥物制備及給藥地黃飲子加減方：藥物浸泡后，反復2次煎煮濃縮成178%的混懸液，最終每劑藥濃縮成55.6 ml，每毫升含生藥1.78 g，經高壓滅菌后放進冰箱4 ℃冷藏備用。

給藥方法：在病證結合造模第3周予DHYZ組灌胃給藥，依據大鼠與人體的體表面積折算等效比率計量表，算出大鼠等效劑量為1 ml/100 g/d。其余各組大鼠用同樣方法注入等體積生理鹽水。每天給藥，每天1次，連續4周。

1.3.4 行為學測試一般行為學觀察：觀察各組大鼠外觀形態、行動反應能力等。依以下標準劃分等級類別[12]：1分：拘捕表現變弱、毛發臟黃可見、弓背抬高及自主活動稍減少；2分：1分的基礎上，大鼠自主活動弱化、行為緩慢且平衡力減弱；4分：2分基礎上，平衡力明顯變差，甚則無法直線行走，前進時或有呈一側偏轉傾向；6分：4分基礎上，大鼠呈臥向單側姿態行步，癱軟、較少主動前進行為、進食減少；8分：6分基礎上，大鼠體態臥向一側、無法行進、進食停止；10分：綜合以上，大鼠表現有癱瘓、體質量降低明顯，生命體征弱或已死亡狀態。行為學評分3分及以上考慮為造模成功。

懸掛實驗：根據KURIBARA實驗說明，制作懸掛儀器[10]。用直徑為1.5 mm的鐵絲，水平固定于支架兩端。支架左右距離間隔15 cm，離地面高度為20 cm。懸掛絲下放置敷料墊，防止大鼠墜落造成傷害。觀察大鼠兩前肢穩定抓握鐵絲，開始計時記錄大鼠懸掛時間。懸掛8 s及以上雙足記5分，單足記4分；懸掛5 s及以上雙足記3分，單足記2分；懸掛不足1 s記0分。其余記1分。

1.3.5 待測樣品制備及測定大腦標本采集:行為學檢測完畢。使用Rand函數，每組選擇5只大鼠行開胸心臟灌注術，使用復合麻藥(水合氯醛、烏來糖5∶1的比例，溶于30 g生理鹽水)以4.5 ml/kg標準進行腹腔注射麻醉各組大鼠。觀察大鼠深度麻醉后，在大鼠左心室處插入注射針頭，剪開右心耳注射灌注0.9%生理鹽水。行進過程中觀察肝臟發白后，改換4%多聚甲醛液進行固定灌注，直至觸摸大鼠頸部、尾部完全僵硬。灌注后迅速取出腦組織，在4%多聚甲醛液重固定1周以上，全部進行石蠟切片處理。

黑質紋狀體采集：大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，放置于冰上進行黑質、紋狀體組織分離術。剝離組織分裝于標號凍存管后移至液氮罐內，結束后一并放-80 ℃冰箱冷凍保存。

α-syn免疫組化檢測：將石蠟切片依次置于不同濃度二甲苯及乙醇溶液內，蒸餾水洗至脫蠟。在盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)中放入切片，高溫下條件下進行抗原修復，自然冷卻后置玻片于PBS試劑液體中洗滌3次，每次5 min。洗滌后在3%雙氧水溶液中，室溫避光孵育25 min，放置于PBS中洗滌3次，每次5 min。洗滌后的切片組化圈內滴加3%BSA溶液，室溫下封閉30 min。滴加PBS及一抗，放入4 ℃孵育過夜。取出切片后使用PBS溶液洗滌3次，每次5 min。組化圈內滴加相對種屬的HRP標記物，室溫下孵育50 min。置于PBS溶液中洗滌3次，每次5 min。稍風干后加DAB顯色液，顯微鏡下觀察實驗結果，陽性為棕黃色。顯色結束后自來水沖洗切片。用蘇木素復染后自來水沖洗。等待切片自然干燥后，使用中性樹膠封片。每組內使用Rand函數隨機選取5個組織，每組織每張切片拍出至少3個200 X照片，應用IPP 6.0軟件進行光密度分析，計算3張照片的平均光密度值。

2 結果

2.1 一般情況實驗過程中PDZC、PDJB、SXYY組大鼠存活率為100%，DHYZ組因魚藤酮毒性致死2只，操作失誤致死2只。

觀察各組大鼠造模情況可得，PDZC組大鼠形態正常，毛色干凈潔白，且活動反應靈敏，體質量穩定增長。PDJB組第7天左右進食減緩，呈現弓背姿勢，毛色發黃變臟。SXXY組皮毛臟黃，重心降低，且捕捉抵抗力明顯變弱，自潔能力明顯變差。DHYZ組較SXXY組有所改善，具備基本自潔能力，且拘捕具有明顯抵抗，毛色趨于PDZC組。

2.2 體質量變化相比較前3周各組大鼠造模過程體質量變化。與PDZC組比較，PDJB、SXXY、DHYZ組體質量增長明顯延緩，SXXY組與PDZC組比較體質量，差異具有統計學意義(P<0.05)；DHYZ組相較SXXY組體質量改善，差異具有統計學意義(P<0.01)。說明地黃飲子加減方可顯著提高PD大鼠生存質量。見表1。

表1 各組大鼠體質量變化比較

2.3 行為學評分結果根據行為學評分標準，觀察記錄各組大鼠實驗后行為學表現。與PDZC組比較，PDJB、SXXY、DHYZ組分數差異明顯。SXXY組較PDZC組分數增高，差異具有統計學意義(P<0.05)；DHYZ組較SXXY組分數明顯降低，差異具有明顯統計學意義(P<0.01)。說明地黃飲子加減方可使PD大鼠異常行為得到修正，提升大鼠生活狀態。見表2。

表2 各組大鼠行為學檢測評分結果比較(分，

2.4 懸掛實驗測試結果基于懸掛評分高低考察大鼠身體肌力及協調能力，高分代表大鼠四肢肌力及協調能力正常，低分反之。根據表3結果示，與PDZC組相比，PDJB、SXXY、DHYZ組懸掛實驗得分低，差異具有統計學意義(P<0.05)。DHYZ組相較SXXY組實驗得分高，差異具有明顯統計學意義(P<0.01)說明SXXY組四肢肌力減退，協調能力差，DHYZ組肢體肌力有所恢復，協調能力良好。

表3 各組大鼠懸掛實驗評分結果比較 (分，

2.5 各組大鼠免疫組化結果以PDZC組實驗大鼠為參考，SXXY組黑質紋狀體內α-syn平均光密度值升高，差異有統計學意義(P<0.05)；以SXYY組實驗大鼠作為參考，DHYZ組大鼠黑質紋狀體內α-syn平均光密度值降低差異有顯著統計學意義(P<0.01)。說明對比PDZC組，SXXY組大鼠黑質及紋狀體中α-syn含量增多。DHYZ組對比SXXY組大鼠黑質紋狀體內α-syn含量有所控制，證明地黃飲子方加減可有效控制α-syn含量。

注：與PDZC組比較，**P<0.01;與SXXY組比較，##P<0.01。

4組大鼠中腦黑質紋狀體內α-syn免疫組織化學染色檢測結果如圖2、圖3所示，PDZC組內大鼠黑質紋狀體中胞體清晰完整，未見明顯棕褐色核團(α-syn陽性表達)，PDJB組內大鼠黑質紋狀體中可見明顯棕褐色核團群體，SXXU組內大鼠黑質紋狀體內細胞明顯減少，且棕褐色核團表達明顯。DHYZ組內大鼠黑質紋狀體體內雖見細胞核明顯偏移，但細胞數量有所恢復，且棕褐色表達減弱，α-syn表達不明顯。

圖2 各組大鼠黑質內α-syn免疫組化比較

圖3 各組大鼠紋狀體內α-syn免疫組化比較

3 討論

PD為老年病多發性疾病之一，中醫討論歸為“顫證” “顫震”“癡呆”“痙證”等范疇，認為其病位為腦。中醫藏象腎腦系統理論認為，腎藏精，精生髓，髓聚為腦，腦為髓海[11]。腦是主司感覺運動的器官，張錫純明確指出：“人之腦髓空者……甚或猝然昏厥，知覺運動俱廢”。腦髓空虛是運動障礙發生的根本原因。腎精作為腦髓生化之源，異常可導致腦生理功能失常，在老年人多見運動障礙、姿態不穩等。生理上，腎作為先天之本，其物質基礎及功能作用，隨人體的生、長、壯、老自然消耗。腎中陰精化生和陽氣溫煦作為各臟腑維持生理功能及精血津液的重要保證，一旦虧損則臟氣推動無力，化氣無源，導致陰血虧少，機體臟腑失去濡養。氣機升降乖張，血液運行受到影響，導致脈道阻塞形成血瘀。病理上，外感六淫、飲食勞倦、時行疫毒等均可直接或間接損及腎臟，從而導致氣不運血，停積為血瘀。PD好發于高齡人群，中醫討論PD病機總屬本虛標實，從生理與病理分析均可導致腎虛血瘀證的發生，其中腎虛為本，血瘀為標[12]。腎虛血瘀證作為老年病患者的特征[13]，已被李軍艷等[14]證實為PD的基本病機。臨床上治療多使用地黃飲子組方進行干預治療[15]。地黃飲子最早為唐代的補腎方，宋代以后逐漸作為治療中風后腎虛專用方，《黃帝素問宣明論方》記載：“內奪而厥，舌喑不能言，二足廢不為用。腎脈虛弱，其氣厥不至，舌不仁”。此組方中藥物熟地黃、山萸肉以補腎陰，肉蓯蓉、巴戟天共壯腎陽；附片、肉桂、石斛、麥冬、五味子有溫陽固元，引火下行，滋肺腎的功效。前期研究發現,地黃飲子方可以“腎”為靶點[16]。此實驗在地黃飲子方的基礎上加用牡丹皮，補腎同時兼備活血的作用。探討地黃飲子加減方對PD腎虛血瘀證的作用機制，以期為改善臨床治療方案提供實驗基礎，達到對癥治療、早期干預的目的，具有十分重要的臨床價值和社會意義。

現代醫學表明PD發病機制復雜多變，可能受異常蛋白聚集、氧化應激及神經炎癥等影響。其診斷金標準為PD患者大腦黑質、紋狀體神經元胞體內路易小體(Lewy bodies, LBs)的存在。而α-syn作為LBs的重要組成，雖還未明確其與PD的關系。但多學者表明，α-syn的異常聚集是PD發病的重點。α-syn通過病理反應后形成的聚集體能夠引起多巴胺能神經元死亡，進一步導致PD產生運動癥狀[17]。目前中醫藥對PD作用機制多圍繞氧化應激展開，對異常蛋白聚集較少涉及[18]。綜上所述，PD作為一類臨床發病率極高的老年性神經系統疾病，是多種致病機制復雜交錯最終導致α-syn聚集LBs的形成，而地黃飲子加減方能夠抑制黑質多巴胺能神經元損傷[12]，對α-syn含量是否有影響仍待探究。

研究使用頸背部皮下注射魚藤酮溶液方法制備PD大鼠模型，并于此基礎上復合制備腎虛血瘀證PD大鼠模型，實驗大鼠出現弓背向上、運動遲緩等PD行為學表現。PD腎虛血瘀證患者臨床表現不僅表現為步態失衡或震顫，常有多種行為學共存，如病患四肢肌張力升高，運動能力失常所導致的肌肉萎縮，肌肉功能下降，以及腎虛血瘀，久病致瘀，從而影響身體各臟器的正常運轉所表現的體質量減弱。故實驗結合了多種行為學檢測方式以期達到對臨床PD模型的立體化呈現。發現通過地黃飲子加減方干預后的大鼠體質量明顯高于未治療前，與人類PD腎虛血瘀證治療后的體質量表現相同。而行為學及懸掛實驗大鼠評分DHYZ組均高于SXXY組，差異有顯著統計學意義。此外，此實驗大鼠的免疫組化法結果顯示，SXXY組大鼠黑質紋狀體中α-syn平均光密度升高，DHYZ組內α-syn平均光密度降低，提示地黃飲子加減方能夠作用于α-syn，且可在鏡下觀察到其聚集體，但表達含量過低對于檢測黑質紋狀體α-syn是否有特異性仍有待研究。實驗將體質量、多類行為學檢測法、黑質紋狀體內α-syn平均光密度值及免疫組化法結合，證實了地黃飲子加減方對PD腎虛血瘀證黑質紋狀體內α-syn的含量具有影響，且α-syn含量表達呈下降趨勢，為臨床進一步研究PD腎虛血瘀證的特征神經病理變化，改善治療方案，提升治療效果等提供了實驗基礎。但PD腎虛血瘀證致病涉及多種蛋白多種因素的共同參與，且病程漫長易生他變。由此可見地黃飲子加減方可有效降低PD腎虛血瘀證大鼠黑質紋狀體內α-syn含量。但地黃飲子加減方可否能夠通過對其他蛋白或其他因素影響腎虛血瘀證PD大鼠尚未可知，仍有待進一步研究。