基于UPLC-Triple-TOF-MS和網(wǎng)絡藥理學快速建立郁金潛在中藥質(zhì)量標志物成分庫

張寬永，沈 燚，張 璐，張巧艷，蒙雄裕，葛志偉，嚴斌俊*，秦路平*

基于UPLC-Triple-TOF-MS和網(wǎng)絡藥理學快速建立郁金潛在中藥質(zhì)量標志物成分庫

張寬永，沈 燚1，張 璐1，張巧艷1，蒙雄裕1，葛志偉2，嚴斌俊1*，秦路平1*

1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江杭州 310053 2.浙江大學農(nóng)生環(huán)測中心，浙江杭州 310058

根據(jù)中藥質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）的理念，建立不同基源郁金的潛在Q-Marker庫。采用超高效液相色譜-三重四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Triple-TOF-MS）技術，建立郁金化學成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，通過網(wǎng)絡藥理學等方法構建“化學成分-靶點-通路”預測郁金潛在的Q-Marker。郁金藥材中共鑒定出46個化學成分，其中共有成分12個。以共有成分為Q-Marker候選物進行網(wǎng)絡藥理學分析，預測姜黃酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術二酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素和莪術呋喃二烯酮可作用于5羥色胺受體（HTR1A、HTR2A、HTR1D、HTR1B）、阿片受體（OPRK1、OPRM1、OPRD1、OPRL1）等靶點，通過調(diào)控神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、鈣信號通路、cAMP信號通路、逆行內(nèi)源性大麻素信號等重要通路發(fā)揮抗抑郁的作用。通過UPLC-Triple-TOF-MS技術和網(wǎng)絡藥理學方法，可以快速分析和確定中藥郁金的化學成分，建立郁金的潛在Q-Marker庫。

郁金；質(zhì)量標志物；網(wǎng)絡藥理學；姜黃酮；莪術雙環(huán)烯酮；莪術二酮；莪術烯醇；莪術醇；二氫姜黃素；去甲氧基姜黃素；莪術呋喃二烯酮

郁金為姜科植物溫郁金Y.H.Chen & C.Ling、姜黃L.、廣西莪術S.G.Lee et C.F.Liang、蓬莪術Val.的干燥塊根，具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃的功效[1]。現(xiàn)代研究表明郁金主要含有揮發(fā)油類、姜黃素類和多糖類等成分[2]，具有抗抑郁[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗炎[7]、促進消化[8-9]、保肝利膽[10]等藥理作用。《中國藥典》2020年版一部中收載了4種基原植物均可作為郁金臨床藥用，但并未收載關于郁金的含量測定方法。劉昌孝院士[11]于2016年首次提出了中藥質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）的新概念，用于完善藥材的質(zhì)量控制標準。因此找出郁金藥材的Q-Marker成為現(xiàn)在郁金藥材及相關制劑質(zhì)控的迫切需求。

郁金是中醫(yī)治療抑郁癥的常用藥，李濤等[12]通過對70位從事中醫(yī)藥防治抑郁癥當面的專家進行問卷統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)郁金是中醫(yī)臨床治療抑郁癥最常用的9種中藥之一。有文獻報道郁金對不同抑郁癥模型大、小鼠均有顯著的抗抑郁作用[13-14]，作為郁金同源的姜黃和莪術卻未見抗抑郁的相關報道。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)對4種郁金共同研究的報道較少，王雪梅等[15]通過氣相質(zhì)譜檢測了4種郁金石油醚提取物中的成分差異。但郁金中的倍半萜類成分受熱易分解，有文獻報道莪術雙環(huán)烯酮受熱易發(fā)生重排[16]，吉瑪烷型倍半萜受熱易發(fā)生環(huán)化反應[17]。故本實驗擬采用超高效液相色譜-三重四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Triple-TOF-MS）對不同基原郁金飲片的化學成分進行快速識別，系統(tǒng)分析4種基原郁金化學成分的異同，篩選出4種基原郁金共有化學成分作為標記化合物，通過網(wǎng)絡藥理學研究方法分析相關成分的作用靶點和作用機制，確定郁金潛在的Q-Marker，為郁金藥材Q-Marker系統(tǒng)質(zhì)控方法奠定基礎。

1 材料

12批不同基原和產(chǎn)地的郁金飲片，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學張巧艷教授鑒定為溫郁金Y.H.Chen & C.Ling、姜黃L.、廣西莪術S.G.Lee et C.F.Liang、蓬莪術Val.的干燥塊根。具體批號和來源見表1。

表1 郁金樣品來源信息

Table 1 Source information of Curcuma Radix samples

產(chǎn)地批號樣品類型樣品來源 浙江ZY0307溫郁金浙江中醫(yī)藥大學飲片廠 ZY0207溫郁金浙江中醫(yī)藥大學飲片廠 ZY1112溫郁金浙江中醫(yī)藥大學飲片廠 廣西GY0412廣西莪術亳州中藥材市場 GY0317廣西莪術亳州中藥材市場 GY1115廣西莪術亳州中藥材市場 四川CY0409蓬莪術亳州中藥材市場 CY0503蓬莪術亳州中藥材市場 CY1107蓬莪術亳州中藥材市場 HY1011姜黃四川新荷花中藥飲片廠 HY0421姜黃四川新荷花中藥飲片廠 HY0722姜黃四川新荷花中藥飲片廠

AcquityTMultra型高效液相色譜儀和Triple TOF 5600＋型飛行時間質(zhì)譜（Waters公司，美國）；電噴霧離子源（AB SCIEX公司，美國）；GL224-1SCN萬分之一電子天平（賽多利斯儀器有限公司）。

對照品姜黃素（批號CFS201901）、雙去甲氧基姜黃素（批號CFS201901）購自武漢天植生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥98%。莪術烯醇（批號201603，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自青島捷世康生物科技有限公司。莪術二酮（批號150610，質(zhì)量分數(shù)＞95%）、莪術醇（批號150129，質(zhì)量分數(shù)＞95%）、吉馬酮（批號151027，，質(zhì)量分數(shù)＞98%）購自成都植標化純生物技術有限公司。莪術酮（批號T13D7Z26820，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。莪術呋喃二烯酮（批號160121，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自四川維克奇生物技術公司。實驗室從溫郁金餾份中分離得到莪術雙環(huán)烯酮，質(zhì)量分數(shù)＞98%（峰面積歸一化法在254 nm波長處測定），其結構經(jīng)1H-和13C-NMR（核磁共振譜）確證，并與文獻數(shù)據(jù)進行了比較[18]。甲醇和乙腈（色譜純，美國天地試劑公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取不同基原的郁金粉末各1 g, 精密稱定，置于錐形瓶中精密加入甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷后用甲醇補足質(zhì)量，搖勻，濾過。取濾液在離心機中以10 000 r/min離心5 min，取上清液待用。

2.2 對照品溶液的制備

莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術二酮、莪術酮、莪術呋喃二烯酮、莪術醇、吉馬酮、姜黃素和雙去甲基姜黃素各對照品分別制成質(zhì)量濃度為2780、346、458、2094、482、232、260、452和228 μg/mL的對照品甲醇溶液，于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒炃叭∩鲜鰧φ掌穬湟焊?00 μL置于10 mL量瓶中，配成混合對照品溶液待用。

2.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，0～8 min，10%～41% B；8～10 min，41%B；10～16 min，41%～95%B；體積流量為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為214 nm；進樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 UPLC-Triple-TOF 5600＋飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀：正離子掃描模式；掃描范圍/100～1500；霧化氣（GS1）：379 kPa；霧化氣（GS2）：379 kPa；氣簾氣（CUR）：241 kpa；離子源溫度（TEM）：600 ℃；離子源電壓（IS）：5500 V；一級掃描：去簇電壓（DP）：100 V；聚焦電壓（CE）：10 V；二級掃描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為20、40 eV，進樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2×10?6。

2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)國內(nèi)外郁金及其近屬植物的化學成分研究的相關文獻和報道，借助Scifinder、Reaxys和Pubchem數(shù)據(jù)庫整理出郁金化學成分數(shù)據(jù)庫。利用液質(zhì)聯(lián)用儀采集4種郁金正離子下的總離子流圖數(shù)據(jù)，使用Peakview1.2軟件（Sciex公司，美國）對總離子進行提取。將數(shù)據(jù)庫導入PeakView的XIC Manager模塊中，通過XIC計算功能構建目標化合物的列表。方法參數(shù)設置如下：強度＞500，信噪比（/）＞10，同位素比率≤20%，質(zhì)量誤差≤1×10?5。進行計算后，符合數(shù)據(jù)庫要求的化合物被提取并突出顯示。根據(jù)分子離子峰和碎片離子峰的相對強度獲得每種化合物的離子流質(zhì)譜圖。通過比較對照品或者文獻信息，例如保留時間和質(zhì)譜二級碎片離子，最終鑒定郁金提取物中的化合物。

2.5 網(wǎng)絡藥理學預測郁金化合物對抗抑郁的作用機制

2.5.1 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建 根據(jù)質(zhì)譜化合物成分分析，選出標記化合物作為潛在的Q-Marker，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http:// www.swisstargetprediction.ch/），獲得化合物靶點（得分＞0）。通過OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）搜索“depression”，獲得疾病靶點。最后將化合物-靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件得到化合物-疾病靶點網(wǎng)絡圖。

2.5.2 蛋白質(zhì)相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建及核心靶點分析 將上述藥物-疾病共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string- db.org/）進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構建PPI網(wǎng)絡。

2.5.3 功能富集分析與通路分析 基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包以值＜0.05，值＜0.05進行關鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析。

3 結果與分析

3.1 UPLC-Triple-TOF-MS的采集

利用“2.3”項下建立的分析方法在正離子模式下采集的4種基原郁金飲片的總離子流圖見圖1。

3.2 化合物分析

根據(jù)總結郁金藥材中的9個對照品質(zhì)譜碎片離子和裂解規(guī)律等信息，分別鑒別出姜黃素類成分和10種結構類型的倍半萜類成分，見表2。共46中化合物，其中溫郁金39種、廣西莪術40種、蓬莪術40種、姜黃17種。

3.2.1 姜黃素類 4種基原郁金中鑒別出4種成分，化合物27、28、33、34，化合物27（R＝10.08 min）在正離子模式下/371.1518 [M＋H]+，質(zhì)譜軟件計算出精確分子式為C21H22O6，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要離子碎片為177.054 4 [M＋H－C11H13O3]+、145.028 6 [M＋H－C11H13O3－CH3O]+、137.060 1 [M＋H－C13H13O4]+，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定化合物27為二氫姜黃素，推測其裂解途徑見圖2。化合物28、34通過對照品對比確定為雙去甲氧基姜黃素和姜黃素。化合物33（R＝11.08 min）在正離子模式下/339.123 4 [M＋H]+，質(zhì)譜軟件計算出精確相對分子質(zhì)量，確定分子式為C20H18O5，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要離子碎片為/177.055 1 [M＋H－C10H9O2]+，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索及文獻報道[20]，推測化合物33為去甲氧基姜黃素。

A-對照品 B-姜黃 C-廣西莪術 D-溫郁金 E-蓬莪術

3.2.2 倍半萜類 4種基原郁金中鑒別出愈創(chuàng)木烷型12個、桉烷型3個、檀香烷型2個、吉瑪烷型8個、欖烷型3個、卡布達烷型4個，杜松烷型2個、沒藥烷型7個、拉松烷型1個、艾里莫酚烷型1個。

表2 郁金飲片化學成分分析

Table 2 Identification analysis of components of Curcuma Radix

編號tR/minm/z偏差(×10?6)二級離子(m/z)分子式化合物名稱化合物分類理論值實測值 11.56281.138 35281.138 530.7 281.138 2, 245.118 4, 157.102 1, 107.050 4C15H20O5zedoalactone B[19]愈創(chuàng)木烷型 21.79283.154 00283.153 83?0.6 229.123 0, 201.125 6, 173.113 1, 145.100 4C15H22O5zedoarolide B[19]愈創(chuàng)木烷型 33.35267.159 09267.159 240.6 249.148 3, 231.138 7, 203.142 6, 173.095 5C15H22O4zedoalactone A[19]愈創(chuàng)木烷型 43.51253.179 82253.179 75?0.3 253.181 0, 235.171 6, 177.125 7, 159.116 9C15H24O3莪術奧酮二醇[20]愈創(chuàng)木烷型 56.14247.132 87247.132 72?0.6 247.134 0, 229.122 9, 201.122 8C15H18O3姜黃醇酮[21]桉烷型 66.16265.143 44265.143 430.0 265.142 8, 247.133 0, 229.122 4, 201.122 8C15H20O4姜油酚[20]桉烷型 76.29253.179 82253.179 43?1.6 235.179 4, 235.170 8, 217.159 7, 151.113 1C15H24O3異莪術奧酮二醇愈創(chuàng)木烷型 86.41245.117 22245.117 461.0 245.117 1, 229.085 9, 181.101 4、C15H16O3cucumin C檀香烷型 96.45233.153 61233.153 660.2 135.080 7, 115.055 0, 107.086 4, 91.056 0C15H20O2姜黃酮醇A[22]沒藥烷型 106.66229.122 31229.122 430.6 229.122 3, 201.127 4, 187.075 4, 159.080 4C15H16O2cucumin A[20]檀香烷型 116.70251.164 17251.164 270.4 233.151 1, 215.141 5, 191.142 3, 109.066 3C15H22O3莪術二醇[19]愈創(chuàng)木烷型 127.10265.143 44265.143 39?0.2 265.144 4, 247.134 9, 205.086 0, 105.071 7C15H20O4姜黃內(nèi)酯C蒈烷型 137.25249.148 52249.148 540.1 249.148 3, 204.143 3, 143.085 8, 105.071 3C15H20O3姜黃內(nèi)酯A[19]蒈烷型 147.51237.184 91237.185 100.8 237.177 6C15H24O2莪術二酮*吉瑪烷型 157.62247.132 87247.132 920.2 247.134 3, 229.122 0, 189.092 0, 183.117 7C15H18O3蓬莪術環(huán)氧酮[20]吉瑪烷型 167.65265.143 44265.143 440 247.129 1, 229.123 7, 121.102 7, 91.056 3C15H20O4zedoarofuran[20]桉烷型 177.80249.148 52249.148 520 249.149 6, 189.127 6, 107.087 7C15H20O3germaerone-4,5-epoxide[20-21]吉瑪烷型 187.89251.164 17251.164 230.2 251.170 6, 233.154 3, 215.144 6, 205.160 1C15H22O3原莪術二醇[20-21]愈創(chuàng)木烷型 198.81235.169 26235.169 400.6 217.158 4, 189.162 9, 161.096 5, 133.109 9C15H22O2莪術烯醇*愈創(chuàng)木烷型 208.81235.169 26235.169 400.6 235.169 8, 177.127 9, 161.096 5, 133.100 9C15H22O2莪術雙環(huán)烯酮*蒈烷型 219.18229.122 31229.122 480.8 229.123 5, 211.112 1, 201.127 5C15H16O2莪術酮[19]杜松烷型 229.18247.132 87247.133 171.2 229.121 1, 159.079 9, 139.039 2, 123.044 9C15H18O3zedoarol[20]愈創(chuàng)木烷型 239.20237.184 91237.185 251.4 237.185 3, 219.174 5, 135.117 1, 107.086 8C15H24O2新莪術二酮[19, 21]吉瑪烷型 249.43217.158 69217.158 941.1 217.159 4, 189.163 7, 105.107 8C15H20OcomosoneII[20]杜松烷型 259.52237.184 91237.185 090.8 237.185 0, 219.174 2, 191.179 2, 135.117 1C15H24O2莪術醇*愈創(chuàng)木烷型 269.53219.174 34219.174 420.3 219.178 6, 201.164 0, 163.124 1, 147.117 4C15H22O甜沒藥姜黃醇沒藥烷型 2710.08371.148 92371.149 561.7 219.174 2, 177.054 7, 145.028 6, 137.060 1C21H22O6二氫姜黃素姜黃素類 2810.62309.112 14309.112 320.6 309.112 8, 225.091 0, 147.044 1C19H16O4雙去甲氧基姜黃素*姜黃素類 2910.64215.143 04215.142 92?0.6 215.142 6, 197.132 3, 173.095 6, 167.084 7C15H18Oagassizin[20]愈創(chuàng)木烷型 3010.64233.153 61233.153 52?0.4 233.153 7, 215.143 5, 175.112 9, 147.079 6C15H20O2呋喃大牻牛兒酮[19]吉瑪烷型 3110.69221.189 99221.189 96?0.2 221.191 1, 203.184 3, 123.118 2, 109.103 5C15H24O莪術油[19]沒藥烷型 3210.93231.137 96231.138 040.4 231.138 4, 213.127 6, 249.060 5, 135.081 4C15H18O2莪術呋喃烯酮*欖烷型 3311.08339.122 7339.123 542.2 255.101 8, 223.076 0, 177.055 1, 147.044 4C20H18O5去甲氧基姜黃素姜黃素類 3411.44369.133 27369.133 570.8 253.086 1, 177.054 4, 161.059 9C21H20O6姜黃素*姜黃素類 3511.47217.158 69217.158 880.9 217.159 0, 199.148 5, 161.096 6, 105.071 6C15H20O莪術呋喃二烯吉瑪烷型 3611.40231.137 96231.138 120.7 231.138 3, 213.127 3, 173.096 1, 161.059 6C15H18O2莪術呋喃二烯酮*吉瑪烷型 3711.56213.127 39213.127 601.0 233.153 0, 205.158 5C15H16Opyrocurzerenone[20]拉松烷型 3811.63229.122 31229.122 29?0.1 229.122 2, 214.098 7, 167.084 9C15H16O2桂莪術內(nèi)酯[20]愈創(chuàng)木烷型 3911.78219.174 34219.174 510.8 219.174 1, 159.116 5, 145.101 1, 91.056 0C15H22O吉瑪酮*吉瑪烷型 4011.87231.137 96231.138 321.6 231.137 5, 213.127 1, 203.143 7, 137.060 1C15H18O2表莪術酮[19]欖烷型 4112.52217.158 69217.158 890.9 119.086 3, 91.056 3, 77.041 7C15H20O芳姜黃酮[22]沒藥烷型 4212.63219.174 34219.174 26?0.4 219.174 8, 109.102 5, 67.058 3C15H22O諾卡酮[20]艾里莫酚烷型 4312.67203.179 43203.179 460.2 203.179 1, 147.116 7, 119.086 6, 105.072 2C15H22姜黃烯[20]沒藥烷型 4412.88205.195 08205.195 130.2 205.195 2, 149.130 2, 135.114 6, 109.102 9C15H24β-欖烯香[20]欖烷型 4513.30219.174 34219.174 400.3 121.101 7, 105.071 3, 93.071 5, 83.051 7C15H22O姜黃酮[21]沒藥烷型 4613.51205.195 08205.195 090.1 149.132 5, 121.101 7, 107.086 7, 93.071 8C15H24α-姜烯[20]沒藥烷型

*與對照品進一步確認

*further confirmed with reference substances

圖2 二氫姜黃素裂解過程

（1）愈創(chuàng)木烷型：化合物22（R＝9.18 min）在正離子模式下/237.185 1 [M＋H]+，質(zhì)譜軟件計算出精確分子式為C15H18O3，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要碎片離子為/229.121 1 [M－H2O]+，與文獻數(shù)據(jù)比對，鑒定化合物為zedoarol。化合物19、25通過對照品對照分別確定為莪術烯醇、莪術醇。

（2）吉瑪烷型：郁金樣品中，化合物14、15、17、24、30、35、36、39為吉瑪烷型倍半萜。分別為莪術二酮、蓬莪術環(huán)氧酮、germaerone-4,5- epoxide、新莪術二酮、呋喃大牻牛兒酮、莪術呋喃二烯、莪術呋喃二烯酮、吉瑪酮。以莪術二酮和吉馬酮為例，莪術二酮在正離子模式下/237.184 7 [M＋H]+，質(zhì)譜軟件計算出精確分子式為C15H24O2，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要碎片離子為/219.174 2 [M＋H－H2O]+，雙鍵進一步裂解得到135.117 4、107.087 4，與對照品比對，鑒定化合物14為莪術二酮。在正離子模式下/219.174 2 [M＋H]+，質(zhì)譜軟件計算出精確分子式為C15H22O，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要碎片離子為/201.165 0 [M＋H－H2O]+，雙鍵進一步裂解得到/177.127 4、135.116 7、107.086 1與對照品比對，鑒定化合物39為吉馬酮。質(zhì)譜裂解途徑見圖3。吉瑪烷型倍半萜多以酮類為主，易發(fā)生麥氏重排脫去-H2O，然后主要以雙鍵的α裂解為主要裂解途徑。

（3）沒藥烷型：共鑒定了8種沒藥烷型倍半萜被，以化合物31（R＝10.69 min）為例，正離子模式下/221.191 1 [M＋H]+，計算出精確分子式為C15H24O，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要碎片離子為/221.191 1、203.184 3、109.103 5、81.075 7，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索和參考文獻數(shù)據(jù)[19]鑒定化合物為bisacurol。化合物45（R＝13.3 min），正離子模式下/219.174 4 [M＋H]+，計算出精確分子式為C15H22O，觀察二級質(zhì)譜離子碎片，主要碎片離子為/121.101 0、105.107 1、93.070 6、53.050 8，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索鑒定化合物為姜黃酮，裂解途徑見圖4。沒藥烷型倍半萜易在環(huán)外C-C鍵處發(fā)生裂解也易在雙鍵處發(fā)生α裂解。

3.3 共有成分分析

4種郁金進行共有成分分析，得到12種共有成分，分別為姜黃內(nèi)酯C、莪術二酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術呋喃二烯酮、姜黃烯、β-欖烯香、姜黃酮和姜烯。見表3。

3.4 潛在Q-Marker預測

3.4.1 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建 將4種郁金12個共有成分作為化學標記物進行網(wǎng)絡藥理學分析，確定郁金治療抑郁的潛在Q-Marker。得到326個化學成分相關靶點及430個疾病靶點。兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點77個。

3.4.2 PPI網(wǎng)絡構建 對12個潛在活性成分與77個藥物-疾病共同靶點進行分析，得到“成分-靶點-疾病”PPI的網(wǎng)絡圖并構建蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡（圖5）。圖中綠色代表藥物成分中的9種活性成分為姜黃內(nèi)酯C、莪術二酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術呋喃二烯酮和姜黃酮（姜黃烯、β-欖烯香和姜烯3個活性成分靶點與疾病靶點無交集，予刪除），藍色代表77個共同靶點，紅色代表疾病。PPI圖中節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關聯(lián)，節(jié)點的邊越密集，表明degree值越大，說明其在郁金抗抑郁的過程中就發(fā)揮更重要的作用。其中姜黃酮degree值為37，莪術雙環(huán)烯酮degree值為30，莪術二酮degree值為24，莪術烯醇degree值為10，二氫姜黃素degree值為14，去甲氧基姜黃素degree值為14，莪術醇degree值為13，莪術呋喃二烯酮degree值為8，姜黃內(nèi)酯C degree值為6。姜黃酮、莪術雙環(huán)烯酮和莪術二酮對應的靶點更多作用更大。

圖3 莪術二酮(A) 和吉瑪酮(B) 裂解過程

圖4 Bisacurol (A)和姜黃酮裂解過程(B)

表3 不同藥材來源郁金飲片共有成分和交叉存在成分分析

Table 3 Common and cross-existent components analysis of Curcuma Radix pieces from four different sources

不同基原植物數(shù)量/個共有成分名稱 溫郁金、廣西莪術、姜黃、蓬莪術12姜黃內(nèi)酯C、莪術二酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術呋喃二烯酮、姜黃烯、β-欖烯香、姜黃酮和α-姜烯 溫郁金、廣西莪術、蓬莪術21zedoalactone B 、zedoarolide B、zedoalactone A、莪術奧酮二醇、姜油酚、異莪術奧酮二醇、姜黃內(nèi)酯A、蓬莪術環(huán)氧酮、zedoarofuran、germaerone-4,5-epoxide、原莪術二醇、zedoarol、comosone II、新莪術二酮、甜沒藥姜黃醇、agassizin、呋喃大牻牛兒酮、莪術油、莪術呋喃二烯、pyrocurzerenone、吉瑪酮 廣西莪術、蓬莪術5姜黃醇酮、姜黃素C、姜黃素A、桂莪術內(nèi)酯、諾卡酮 溫郁金、姜黃2莪術呋喃烯酮、姜黃素 廣西莪術、姜黃1芳姜黃酮 蓬莪術、姜黃2雙去甲氧基姜黃素 溫郁金2莪術酮、表莪術酮 姜黃1姜黃酮醇

圖5 成分-靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡圖和核心靶點的PPI網(wǎng)絡

Fig.5 Network diagram of component-target-disease interaction and PPI network of core targets

3.4.3 核心靶點分析及KEGG富集分析 將PPI網(wǎng)絡導入Cystoscap 3.7.2中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以degree、betweenness centrality、average shortest path length和closeness centrality這4個參數(shù)為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為核心靶點，將前30個靶點使用R 3.6.1繪制條形圖。根據(jù)拓撲分析進行核心靶點篩選，主要包括5羥色胺受體（HTR1A、HTR2A、HTR1D、HTR1B）、阿片受體（OPRK1、OPRM1、OPRD1、OPRL1）等主要靶點。將77個共同靶點進行KEGG通路分析，Padjust代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。由圖6可知，4個標記化合物抗抑郁關鍵靶點主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、鈣信號通路、cAMP信號通路、逆行內(nèi)源性大麻素信號等15條信號通路。

4 討論

郁金在臨床中應用十分廣泛[23]，有很多關于其在治療抑郁癥的研究和報道[4,13,24]，《中國藥典》2020年版中4種基原郁金藥材均可作為正品郁金藥用，但由于郁金在外觀和內(nèi)在質(zhì)量均存在較大差異。迄今為止郁金藥材和飲片尚未建立合適的質(zhì)量評價標準。

圖6 核心靶點及KEGG富集分析

本研究基于劉昌孝院士提出的Q-Marker概念，通過UPLC-Triple-TOF-MS技術對4種基原郁金中的化合物進行了定性分析。通過UPLC-Triple-TOF- MS技術對4種基原郁金的化學成分進行快速鑒別，共檢測到46個化合物，其中溫郁金共鑒別出39個，廣西莪術鑒別出40個，蓬莪術鑒別出40個，姜黃鑒別出17個。主要包括姜黃素類成分和10種不同結構類型的倍半萜類成分。初步找出4種郁金的12個共有化合物為姜黃內(nèi)酯C、莪術二酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術呋喃二烯酮、姜黃烯、β-欖烯香、姜黃酮和姜烯。并基于找出的共有化合物作為郁金潛在的化學標記物進行網(wǎng)絡藥理學研究，發(fā)現(xiàn)姜黃內(nèi)酯C、莪術二酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術呋喃二烯酮和姜黃酮9個化合物可通過5羥色胺受體（HTR1A、HTR2A、HTR1D、HTR1B）、阿片受體（OPRK1、OPRM1、OPRD1、OPRL1）等主要靶點對抑郁癥中的神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路等關鍵信號通路發(fā)揮藥理作用。

有實驗研究表明姜黃酮在小鼠絕望實驗中具有明顯的抗抑郁活性，可以降低血液中皮質(zhì)酮水平，同時增加皮質(zhì)、紋狀體、海馬體和下丘腦中5-羥色胺水平，達到抗抑郁效果[25-26]。有文獻報道莪術雙環(huán)烯酮和莪術烯醇具有抗氧化活性和神經(jīng)保護作用，可以改善過氧化氫誘導的小鼠神經(jīng)母細胞瘤-大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜交瘤細胞的氧化應激[27]。細胞體外實驗表明莪術二酮、莪術醇和莪術呋喃烯酮可以通過劑量相關的方式抑制跨膜蛋白16A介導的電流流入，同時能抑制細胞內(nèi)鈣離子濃度和鉀離子通道[28]。二氫姜黃素和雙去甲氧基姜黃素為姜黃素類似物，有很多關于姜黃素抗抑郁的報道[29-31]。Li等[32]通過細胞胞吐實驗，發(fā)現(xiàn)姜黃素和雙去甲基姜黃素可以可調(diào)節(jié)PC12細胞中單胺的釋放而改善記憶和學習。二氫姜黃素是姜黃素的主要代謝產(chǎn)物之一，可以抗氧化、調(diào)血脂和保護肝臟等，Yu等[33]通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)二氫姜黃素可以通過調(diào)節(jié)甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1C、Patatin樣磷脂酶結構域蛋白3和過氧化物酶體增殖物激活受體-α的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平來降低細胞三酰甘油的水平，同時通過增加pAKT和PI3K的蛋白質(zhì)表達水平來改善肝細胞葡萄糖攝取。姜黃內(nèi)酯C未見有抗抑郁的報道，但有文獻報道其對小鼠的急性肝損傷有保護作用[34]。結合Q-Marker“五原則”的可測性和文獻有效性佐證，將姜黃酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術二酮、莪術烯醇、莪術醇、二氫姜黃素、去甲氧基姜黃素和莪術呋喃二烯酮作為郁金潛在的Q-Marker。

本研究采用UPLC-Triple-TOF-MS技術和網(wǎng)絡藥理學方法，建立各基原郁金化學成分庫可以快速確認其成分，分析預測郁金潛在的Q-Marker，可為全面建立郁金質(zhì)量評價方法及質(zhì)量溯源體系提供理論依據(jù)，還可為含有郁金的復方Q-Marker的篩選提供參考。本實驗在完成多基原，多產(chǎn)區(qū)復雜中藥成分快速指認方面做出探索，為進一步進行郁金藥材 Q-Marker的研究奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Rapid establishment of a database of potential quality markers (Q-Marker) of traditional Chinese medicine inbased on UPLC-Triple-TOF-MS and network pharmacology

ZHANG Kuan-yong1, SHEN Yi1, ZHANG Lu1, ZHANG Qiao-yan1, MENG Xiong-yu1, GE Zhi-wei1, YAN Bin-jun1, QIN Lu-ping1

1.College of Pharmacy, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2.Agricultural and Health Environmental Testing Center of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

According to the concept of Q-Marker of traditional Chinese medicine, to establish a potential Q-Marker library of different sources of Yujin ().Ultra-performance liquid chromatography and triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Triple-TOF-MS) technology was used to establish a high-resolution mass spectrometry database of the chemical constituents of, and the chemical constituents-targets were constructed by methods such as network pharmacology.Point-channel prediction ofQ-Marker.A total of 46 chemical components and 12 common components were identified indecoction pieces.Using common components as Q-Marker candidates for network pharmacology analysis, it was predicted that turmerone, curcumenone, curdione, curcumenol, curcumol, dihydrocurcumin, demethoxycurcumin and furanodienone can act on serotonin receptors (HTR1A, HTR2A, HTR1D, HTR1B), opioid receptors (OPRK1, OPRM1, OPRD1, OPRL1) and other targets, through the regulation of neuroactive ligand-receptor interactions, serotonergic synapses, calcium signaling pathways, cAMP signaling pathways, retrograde endocannabinoids important pathways such as signaling play an anti-depressant effect.UPLC-Triple-TOF-MS technology and network pharmacology methods can be used to quickly analyze and determine the chemical components of traditional Chinese medicine, and establish a potential Q-Marker library of.

; quality marker(Q-Marker); network pharmacology; turmerone; curcumenone;curdione; curcumenol; curcumol; dihydrocurcumin; demethoxycurcumin; furanodienone

R284.1

A

0253 - 2670(2022)09 - 2612 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.003

2022-01-28

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2019ZQ012）；GK2021年浙江省重點研發(fā)項目（21-308）

張寬永（1994—），碩士研究生。Tel: 19157739098 E-mail: 1192572210@qq.com

通信作者：秦路平，博士，教授，主要從事內(nèi)生菌方向。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

嚴斌俊，博士，副教授，主要從事藥物分析方向。E-mail: ybinjun@126.com

[責任編輯 王文倩]