貴州鋅硒茶茶多糖的超聲輔助提取工藝優化

李密轉， 李名立， 陳宏燕， 楊邦海， 李秋萍， 許 潔

(遵義醫科大學 公共衛生學院， 貴州 遵義 563003)

0 引言

【研究意義】鳳岡鋅硒茶是貴州省三大名茶之一，是中國國家地理標志產品[1]。茶多糖(Tea Polysaccharides，TPS)是綠茶中一種具有生理活性的酸性復合蛋白，又稱茶活性多糖[2-3]。茶多糖及微量元素結合多糖具有降血糖、防治糖尿病、抗氧化和保肝性、調節免疫力與抗腫瘤、防輻射、保護造血功能、降血壓和抑菌等功能[4-6]。因此，深入研究貴州鳳岡鋅硒茶茶多糖的提取，對開發貴州綠茶資源具有重要意義。【前人研究進展】目前，用于輔助提取茶多糖的方法主要有水浸法、加酶法、微波法、超聲法等[7]，其中水浸法提取效率低，獲得的茶多糖雜質多，易受溫度影響；酶法利用纖維素酶、蛋白酶等破壞植物細胞，提高多糖提取率，但酶法設備要求高，實驗條件要求嚴格，提取茶多糖成本高，不利于擴大生產；微波輔助法能利用瞬時穿透式加熱提高茶多糖提取率，可節省時間和節約能源，但微波提取極難保持恒溫，且存在微波的高能電磁波泄露等問題[8]。運用超聲輔助提取茶多糖，利用超聲的空化效應和機械作用對植物的細胞壁加以破壞，細胞膜的結構殘損，細胞內容物得到更快釋放。此方法不易使茶多糖的化學性質被破壞，且能提高茶多糖的提取率，能耗小、提取時間短、提取得率高、使用溶劑少[9]。【研究切入點】目前，對于貴州鳳岡鋅硒茶茶多糖多采用水提等傳統方法，提取時間長，能耗較大，提取率低[10]。且貴州鋅硒茶中多糖運用超聲輔助提取的研究未見詳實報道。【擬解決的關鍵問題】采用超聲輔助提取貴州鳳岡鋅硒茶的茶多糖，利用響應面法優化提取茶多糖的提取工藝，提高效率、節約能耗，為貴州鋅硒茶的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 貴州鳳岡鋅硒茶購自貴州省鳳岡縣萬壺緣茶業有限公司；D-無水葡萄糖和L-阿拉伯糖購自安徽合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 濃硫酸、丙酮和無水乙醚購自成都市科龍化工試劑廠；無水乙醇、5%苯酚水溶液購自北京綠澤森生物技術有限公司貴州分公司：水為自制蒸餾水。

1.1.3 儀器與設備 BL13-300H型超聲清洗儀購自海比朗儀器有限公司；DGX-8243B型高溫鼓風干燥箱購自海百典儀器設備有限公司；B-220型恒溫水浴鍋購自亞榮生化儀器廠；RE52CS型旋轉蒸發儀購自海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵購自廣州長城工貿有限公司；cence湘儀L500型臺式低速離心機購自廣州滬瑞明儀器有限公司；759型紫外可見分光光度計購自上海菁華有限公司；FA2004N型分析天平購自上海海菁海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 鳳岡鋅硒茶粉碎→過40目篩→超聲(2次)輔助提取(單因素試驗)→過濾除渣→旋轉蒸發(80℃，蒸發至原體積1/4)→醇沉→離心(3 000 r/min，15 min)→洗滌沉淀→干燥→茶多糖。

1.2.2 標準品溶液制備 10 mg/mL葡萄糖供試液：取D+-葡萄糖對照品0.010 0 g加蒸餾水溶解并用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的繪制

1) 全波長掃描。設置掃描波長為200～800 nm，選擇ABS掃描模式，設置1 nm為掃描間距，以空白樣做掃描基線，掃描待測樣品溶液的吸光值。

2) 葡萄糖溶液掃描。分別用移液管移取葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置于已編號試管中，用移液管移取蒸餾水稀釋葡萄糖溶液至2.0 mL，在室溫下向試管中加入1.0 mL的5%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，振蕩搖勻。將水浴鍋溫度設置為40℃，將試管放入水浴鍋中水浴30 min取出，室溫放置10 min。以0 mL葡萄糖溶液為空白對照組。在全波長掃描的結果波長處測定其吸光度。標準曲線縱坐標為吸光度，橫坐標為葡萄糖質量濃度[11]。

1.2.4 換算因子的測定 用分析天平精確稱取20 mg已干燥至恒重的茶多糖至燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，將燒杯中溶液移入100 mL容量瓶定容，質量濃度為0.20 mg/mL。用移液管移取1 mL該水溶液于試管加水稀釋至2 mL，后續步驟按照1.2.3中2)方法測定該水溶液中茶多糖吸光值。按照所得的葡萄糖回歸方程計算提取液中葡萄糖含量C，換算因子按公式(1)計算。

f=m/(C×D)

(1)[11]

式中，m為稱取的多糖質量(mg)，C為稱取多糖中葡萄糖的含量(mg)，D為茶多糖稀釋倍數(此處為2×100)。

1.2.5 提取液中茶多糖含量測定 移取0.1 mL茶多糖提取液于已編號的試管，加水至2 mL，后續步驟按照1.2.3方法測定提取液中茶多糖吸光值。計算鳳岡鋅硒茶中茶多糖提取率[11]。

茶多糖提取率=CD×f/m×100%

(2)[11]

式中，C為茶葉多糖中葡萄糖的含量(mg)，D為多糖的稀釋倍數，f為換算因子，m為稱取的茶葉粉質量(mg)。

1.2.6 單因素試驗 按照超聲時間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)、超聲功率(120 W、150 W、180 W、210 W、240 W)、超聲溫度(65℃、70℃、75℃、80℃、85℃)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30)分別進行單因素試驗。

1.2.7 響應面優化試驗 利用Design-expert 8.0.6中Box-Behnken法，根據單因素試驗結果，固定茶水溶劑比1︰25，確定超聲溫度(A)、超聲時間(B)和超聲功率(C) 3個因素(表1)，以提取液中茶多糖得率為響應值，進行3因素3水平試驗，對超聲輔助提取鋅硒茶中茶多糖的提取工藝加以優化。

表1 響應面分析因素及水平

1.3 數據處理

利用Design-expert 8.0.6分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線與換算因子的計算

2.1.1 全波長掃描 在紫外吸收波長200～800 nm，葡萄糖溶液的最大吸光值于490 nm處出現。

2.1.2 葡萄糖標準曲線 如圖1所示，回歸方程為y= 14.707x+ 0.007 8，R2= 0.995 7，線性關系良好。單因素試驗中，選擇490 nm吸光值。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1.3 換算因子 根據公式(1)計算得到f=3.87。

2.2 不同處理的提取率

由圖2可知，在一定范圍內，提取率著超聲功率的增加而提高，超聲功率為150 W時，提取率最高，之后增大超聲功率，提取率降低。超聲時間和超聲溫度為45 min和70℃時提取率最高，之后隨著時間和溫度的增加，提取率反而降低。料液比在1︰(20～25)時，提取較高。因此，貴州鋅硒茶茶多糖提取的最佳超聲提取功率為150 W、超聲時間為45 min、超聲溫度為70℃、料液比為1︰25。

圖2 不同超聲功率、超聲時間、超聲溫度和料液比的提取率

2.3 響應面優化

2.3.1 回歸方程 由表2和表3可見，利用設定17個點計算不同條件下鋅硒茶中茶多糖的提取率，分析得到茶多糖提取率的回歸方程為Y=7.61+0.0025A-0.092B+0.23C-0.41AB-0.075AC-0.23BC-0.021A2+0.17B2-0.35C2。

由表2可知，該回歸方程顯著(F=4.04，P<0.05)；相關系數R2=0.840 8，說明有超過84%的真實值可以用該模型來反映。失擬項不顯著(F=0.85，P>0.05)，說明該模型能較好反映實際試驗情況。由表2中各參數的P值可知，超聲功率(C)對提取得率有顯著影響，超聲溫度(A)和超聲時間(B)對提取率無明顯影響。AB的交互作用對提取率影響顯著，AC、BC的交互作用對提取率無顯著影響。因素C顯著影響提取率，而其他2個因素的二次方對結果無顯著影響。3個因素對提取率的影響程度為C>B>A，A、B、C兩兩間的交互作用對提取率影響程度為AB>BC>AC。

表2 響應面試驗設計回歸方程參數值

表3 響應面試驗下茶多糖的提取率

2.3.2 響應面與等高線 由圖3可知，AB之間的交互作用顯著影響提取率，AC、BC兩兩間的交互作用對提取率無顯著影響。

圖3 AB、AC、BC交互作用下茶多糖的提取率

2.3.3 驗證 因圖4與圖5殘差曲線沿直線近似，因此滿足正態性假設。圖5中殘差與方程預測值的對應圖，殘差表現出隨機散射，表明原始觀察的方差對于所有值都是恒定的。圖4和圖5比較符合模型。因此，預測模型可以描述響應面的提取率。

圖4 殘差的正態概率

圖5 殘差與預測響應的關系

響應面分析獲得的最優提取條件：超聲溫度71.68℃、超聲時間37.73 min、超聲功率139.05 W。在此條件下預測鋅硒茶茶多糖提取率最大值為7.42%。為檢驗該方法的可靠性，結合實際操作的便利性，將工藝修正為超聲溫度70℃、超聲時間40 min、超聲功率150 W。對修正后工藝進行3次試驗，得到鋅硒茶茶多糖的實際平均提取率為7.05%，與優化的預測值(7.42%)相對誤差為0.37%。

2.4 超聲輔助工藝與未超聲工藝茶多糖提取率的比較

選擇響應面優化的超聲輔助工藝條件：溫度70℃、時間40 min、功率150 W，選擇料液比為1︰25，進行鋅硒茶中茶多糖的提取試驗，選擇不經超聲處理的茶葉樣品為空白組，超聲處理的茶多糖提取率(7.58%)明顯高于不經超聲處理的茶多糖提取率(5.42%)。經超聲處理后，茶多糖的提取率可提高42.50%。

3 討論

茶多糖類化合物的提取若采用超臨界流體技術等新興技術，雖提取效果較好，但其成本高昂，對設備要求高，不利于工業化提取。選擇微波、超聲波等方法提取可以很好地克服以上缺點，在綠色環保的基礎上保證較高的茶多糖提取率。荊晶等[10]采用水提醇沉法提取貴州綠茶中茶多糖，其3個不同產地的綠茶中茶多糖得率為4.73%～5.75%。該研究不采用超聲提取的茶多糖得率為5.42%，與荊晶等[10]的研究結果相當。響應面和等高線圖是考察因素之間兩兩交互作用的關系及顯著性[9,12]。該研究利用單因素和響應面優化兩者結合的試驗方法，采用超聲輔助水提法提取貴州鋅硒茶中的茶多糖，其茶多糖的提取率可以達到7.58%，明顯高于不經超聲處理的茶多糖得率(5.42%)，與陳義勇等[13]的研究結果基本一致，其傳統水溶提取法茶多糖的提取率明顯低于超聲-微波提取法；但與緱鴻達等[14]的研究結果相悖，可能與提取溫度有關。緱鴻達等[14]在水提時水溫為80℃，超聲處理時僅為55℃，熱水提取效果好于超聲效果。

浸提條件對茶多糖提取率的影響有直接關系，超聲波提取法主要是利用超聲波空化產生的極大壓力造成被破碎物細胞壁及整個生物體破裂，而且整個破裂過程在瞬間完成；同時超聲波產生的振動作用加強了胞內物質的釋放、擴散及溶解，加速植物中的有效成分進入溶劑，使其進一步增大有效成分溶出[15]。陳仕學等[16]采用超聲波法提取石阡苔茶中的茶多糖，比常規提取法所得茶多糖含量高出55%。黃永春等[17]比較了傳統水提法和超聲提取粗老綠茶多糖的差異，與傳統的水提法相比，提取率由4.21%提至5.15%。而在該研究中，超聲輔助提取鋅硒茶多糖所得的提取率，與傳統水提法提取鋅硒茶茶多糖相比，提取率由5.42%提至7.58%，與陳仕學等[16-17]的研究結論基本一致。表明，超聲波法在茶多糖的提取方面具有操作方便、高效、綠色環保等特點。

4 結論

以貴州鳳岡鋅硒茶為原料，利用單因素和響應面Box-Behnken分析法對影響貴州鋅硒茶茶多糖提取率的工藝條件進行優化，建立的回歸方程：Y=7.61+0.0025A-0.092B+0.23C-0.41AB-0.075AC-0.23BC-0.021A2+0.17B2-0.35C2。超聲輔助提取鋅硒茶的最佳工藝：超聲溫度(A)70℃、超聲時間(B)40 min、超聲功率(C)150 W、料液最佳配比1︰25。在該條件下，超聲處理茶多糖的提取率可達7.58%，比未經超聲處理的空白組提取率提高42.50%。采用該輔助工藝可為鋅硒茶茶多糖的提取、分離和純化以及鋅硒茶的開發利用奠定基礎。