發酵葛根與水提葛根的抗氧化活性與延緩線蟲衰老的作用研究

趙 丹，吳 迪，李 萌，王昌濤，張佳嬋，王冬冬

北京工商大學化學與材料工程學院 北京市植物資源研究與開發重點實驗室，北京 100048

葛根(Puerarialobata)為豆科葛屬植物的根，在我國分布廣泛。作為傳統的中藥材，葛根具有治療金瘡、解熱生津的作用，在《神農本草經》《本草拾遺》《中國藥典》中均有記載[1,2]。隨著中藥理論的不斷完善，以及人們追求健康的意識不斷提高，許多藥食同源的植物被開發并制成飲料、保健食品。當前研究具有抗衰老功效的植物很多，包括人參、葛根、沙棘、枸杞等[3]。其中葛根的抗衰老活性成分主要包含葛根異黃酮、葛根素、葛根多糖和生物堿。Zhou等[4]發現葛根素能夠顯著改善淀粉樣前體蛋白/早老蛋白-1小鼠的認知障礙，降低腦組織中的氧化應激水平，葛根異黃酮能夠增加大鼠血液和肝臟中抗氧化酶的活性，降低丙二醛的含量。Shao等[5]發現葛根多糖具有延長線蟲壽命的功效。Li等[6]研究表明復方葛根片具有保護血管，抵抗氧化應激損傷，減緩血管老化的作用。

為使葛根功效成分更好地被吸收利用，當前葛根提取的方法多種多樣，如水浴提取[7]、超聲提取[8]、酶法提取[9]等。利用發酵技術對中草藥進行提取，通過微生物代謝產生的次級代謝產物與中藥成分共同作用可達到協同增效的效果，同時由于微生物胞外酶的作用，有助于中草藥活性成分的釋放[10]。

線蟲是研究衰老的典型模式生物，具有易于培養、生長周期短、進化高度保守等特點，同時與人類基因的同源性較高，因此常用線蟲進行抗衰老天然產物的篩選[11,12]。本文利用發酵法和水提法對葛根活性物質進行提取，并從抗氧化能力，對線蟲壽命、產卵、熱應激的影響，探究葛根發酵液與葛根水提液的抗氧化與抗衰老功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃酒酵母，由實驗室保存；大腸桿菌EscherichiacoliOP50、野生型秀麗隱桿線蟲由北京市農林科學院提供。葛根，購于北京同仁堂藥店。

七水硫酸鎂(批號：20170522)、無水氯化鈣(批號：20200817)、磷酸二氫鉀(批號：20190324)、膽固醇(批號：20180916)、氯化鈉(批號：20200415)、次氯酸鈉(20191008)、氫氧化鈉(批號：20180215)、葡萄糖(批號：20190713)、亞硝酸鈉(批號：20190602)、硝酸鋁(批號：20190421)、硫酸亞鐵(批號：20160613)、水楊酸(批號：20180527)、雙氧水(批號：20191120)購自國藥集團化學試劑有限公司；苯酚(批號：20180821)、甲醇(批號：20180506)、濃硫酸(批號：20190615)購自北京化工廠；蛋白胨(批號：20201102)、酵母浸粉(批號：20200713)購自北京拜爾迪生物技術有限公司；維生素C(批號：L2017033)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Trizol試劑(批號：S0147)，總抗氧化能力檢測試劑盒(批號：S0119)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號：S0131S)購自碧云天生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒(批號：011228)購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 儀器和設備

BXM-30R高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司)；TGL-20br高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；Multiskan FC酶標儀(美國賽默飛世爾儀器公司)；Real-time PCR儀(美國應用生物系統公司)；DQHZ-2001A恒溫震蕩培養箱(太倉華美生化儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根發酵液與水提液的制備

制備葛根水提液：取10 g葛根粉末加入200 mL去離子水，70 ℃水浴提取3 h，4 800 r/min離心30 min，取上清液，得到葛根水提液，使用0.22 μm濾膜過濾。

制備葛根發酵液：取10 g葛根粉末加入200 mL去離子水，121℃高壓滅菌，冷卻后，接種黃酒酵母，于28 ℃培養箱中震蕩培養48 h。將發酵液于4 800 r/min離心30 min，得到上清液，使用0.22 μm濾膜備用。

1.2.2 活性成分檢測

黃酮含量檢測采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，多酚檢測采用福林酚還原比色法[13]，葛根素含量檢測采用高效液相色譜法[14]。

1.2.3 抗氧化活性測試

1.2.3.1 總抗氧化能力檢測

取96微孔板，每孔加入20 μL過氧化氫酶工作液；標準曲線孔加入10 μL不同濃度的Trolox標準溶液，樣品檢測孔內加入10 μL不同濃度的樣品；接著每孔加入170 μL ABTS工作液，混合均勻；室溫孵育6 min后于414 nm測定吸光度，根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

1.2.3.2 羥自由基清除能力檢測

取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L PBS和0.5 mL蒸餾水，接著加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后加入0.01%雙氧水0.5 mL。37 ℃水浴1 h后，于536 nm測量吸光值測得數值為A1。

式中，A2為將蒸餾水代替雙氧水測得吸光度值；A樣品為樣品代替蒸餾水測得的吸光度。

1.2.3.3 超氧陰離子清除能力檢測

取0.05 mol/L 的Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液2.25 mL于試管中，置于25 ℃水浴中預熱20 min；分別加入不同濃度的樣品0.05 mL和0.2 mL的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后于25℃水浴中反應5 min；加入0.5 mL 8 mol/L鹽酸終止反應，測量299 nm處吸光值，計算清除率。空白對照組以0.05 mL試樣溶劑代替樣品。

式中，A1為空白的吸光度，A2為樣品的吸光度。

1.2.4 葛根發酵液和水提液對線蟲生長及基因表達的影響

1.2.4.1 線蟲的培養及同期化

配制NGM培養基涂平板，待凝固后，向NGM平板加入200 μLE.coliOP50菌液并涂布均勻，將平板皿置于37 ℃過夜培養。將L4期線蟲轉移至NGM平板，20 ℃培養。

同期化線蟲的培養：選取生長狀態良好的線蟲，用4.5 mL無菌水將其收集至離心管中。加入2 mL裂解液，每隔2 min渦旋振蕩一次，重復4～6次，至線蟲裂解完全。將裂解后的混合溶液轉移至1.5 mL離心管，3 000 r/min離心1 min，棄上清。再加入無菌水沖洗線蟲，離心后棄上清，重復3次。吸取離心管底部蟲卵，滴在涂有E.coliOP50的NGM平板無菌區，直至吹干，20 ℃培養48 h后受精卵發育成L4期線蟲，為后續實驗備用。

1.2.4.2 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲壽命的影響

配制含有不同濃度樣品的平板，使葛根水提液、葛根發酵液在E.coliOP50菌液中的終濃度為1、5 μg/mL，對照組為M9緩沖液。將同期化后的線蟲挑至含有樣品的培養基中于20 ℃培養，每板30條線蟲，每組做三個平行。每天將線蟲挑至新的相應培養皿中并記錄線蟲的存活和死亡數量，直到所有線蟲死亡。若線蟲刺激兩次無反應，判斷其死亡。線蟲發生逃逸、干死、生殖道外翻，則被剔除。根據實驗記錄數據制作線蟲壽命曲線。

1.2.4.3 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲生殖能力的影響

配制含有葛根水提液、葛根發酵液的培養基，使得在E.coliOP50菌液中終濃度為5 μg/mL(壽命實驗篩選出的最佳濃度)，對照組為M9緩沖液。將同期化后的線蟲挑至平板中，每個平板1條線蟲，共10個平行，置于20 ℃培養。每天將線蟲挑至新的平板中，直至產卵期結束，統計每條線蟲的產卵量。

1.2.4.4 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲抗熱應激的影響

配制含有葛根水提液、葛根發酵液的培養基，使得在E.coliOP50菌液中終濃度為5 μg/mL(壽命實驗篩選出的最佳濃度)，對照組為M9緩沖液。將同期化線蟲挑至平板中，每板挑30條線蟲，共10個平行。置于35 ℃培養，開始計時為0 h。每隔2 h將線蟲快速取出，記錄存活和死亡數量。由于平板從培養箱取出，溫度發生變化會對實驗結果造成影響，取出后即丟棄平板。

1.2.4.5 線蟲衰老相關基因檢測

配制含有葛根水提液、葛根發酵液的培養基，使得在E.coliOP50菌液中終濃度為5 μg/mL(壽命實驗篩選出的最佳濃度)，對照組為M9緩沖液。將同期化線蟲挑至平板中。每個平板30條線蟲，共3個平行組。每天將線蟲挑至新的平板中，培養5天后，將成蟲沖洗收集至離心管中，3 500 r/min離心1 min，棄去上清液后用M9緩沖液將秀麗隱桿線蟲重懸，于3 500 r/min離心1 min，重復三次。液氮速凍之后，保存于-80 ℃冰箱備用。使用Trizol法提取線蟲RNA。使用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA后進行熒光定量檢測。基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列表

1.2.5 數據分析

實驗中數據均做三個重復，數據分析使用SPSS statistics 軟件。兩兩比較采用t檢驗，多重比較使用單因素ANOVA，顯著性標準：*P<0.05，**P<0.01。

2 結果與分析

2.1 葛根發酵液與水提液成分分析

葛根富含異黃酮類成分，包含葛根素、大豆苷元和大豆苷等[15]。如表2所示經過發酵，葛根發酵液(fermented broth ofP.lobata，FBP)與葛根水提液(aqueous extract ofP.lobata，AEP)活性成分有明顯區別，其中總黃酮含量有較大增加，增加率約為38.3%，總酚含量降低，葛根素含量增加4.51%。這可能是由于發酵過程中微生物代謝產生的酶將植物細胞壁分解，有助于功效成分的釋放[16]，從而使葛根發酵液中葛根素和黃酮含量增加。

表2 樣品成分含量

2.2 葛根發酵液與水提液的抗氧化功效

2.2.1 葛根水提液、葛根發酵液的總抗氧化能力的檢測

如圖1a所示，當葛根發酵液體積濃度低于5%時，葛根水提液的總抗氧化能力較高，隨著濃度的增加，相同體積濃度的葛根發酵液總抗氧化能力高于葛根水提液，當體積濃度為20%時葛根發酵液的總抗氧化能力最強，約與1.62 mmol/L Trolox標準品相當。因此葛根水提液、葛根發酵液均具有一定的抗氧化能力，且在高濃度時葛根發酵液的總抗氧化能力更強。本實驗陽性對照為Vc，其總抗氧化能力標準曲線如圖1b，200 μg/mL Vc的總抗氧化能力為0.86 mmol/L，與6.67%的葛根發酵液相近。

圖1 不同樣品的總抗氧化能力

2.2.2 葛根水提液、葛根發酵液對羥自由基清除能力的檢測

如圖2a所示，葛根水提液與葛根發酵液對羥自由基的清除能力呈劑量相關。當體積濃度低于5%以內時，兩者清除羥自由基的能力接近，當體積濃度在6.67%～20%之間時，葛根發酵液清除羥自由基的能力大幅增加。葛根發酵液與葛根水提液清除超氧陰離子的IC50分別為5.66%、11.35%。因此兩種發酵液均具有良好的清除羥自由基的能力，且葛根發酵液在高體積濃度時清除羥自由基的能力更強。陽性對照Vc對羥自由基的清除作用與濃度呈正相關，如圖2b所示，Vc清除羥自由基的IC50為39.32 μg/mL。

圖2 不同樣品對羥自由基的清除作用

2.2.3 葛根水提液、葛根發酵液對超氧陰離子清除能力的檢測

如圖3a所示，當樣品體積濃度在4%～20%時，葛根發酵液清除超氧陰離子能力始終高于葛根水提液，當體積濃度達到20%時，葛根發酵液、葛根水提液對超氧陰離子清除率分別為97.5%、82.5%。葛根發酵液和水提液清除超氧陰離子的IC50分別為4.21%和6.68%。陽性對照Vc清除超氧陰離子的效果如圖3b所示，其對超氧陰離子的清除能力與作用濃度呈正相關，IC50為23.8 μg/mL。

圖3 不同樣品對超氧陰離子的清除作用

2.3 葛根發酵液與水提液延緩線蟲衰老的功效

2.3.1 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲壽命的影響

葛根水提液、葛根發酵液對線蟲壽命的影響如表3所示。1 μg/mL葛根發酵液作用組線蟲的平均壽命為14.56±1.01天，最大壽命為26.39±1.44天，均高于對照組。5 μg/mL葛根發酵液作用線蟲的平均壽命為17.38±1.08天，顯著高于對照組(P<0.05)，最大壽命為30.82±1.61天，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。葛根水提液實驗組中，與對照組相比，1 μg/mL和5 μg/mL實驗組線蟲的平均壽命和最大壽命均無顯著性差異。由此可知，5 μg/mL葛根發酵液能夠顯著延緩線蟲的衰老，增加線蟲的壽命。

表3 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲壽命的影響

由線蟲的生存曲線可以得知，實驗的第1天至第8天，線蟲均處于良好的生存狀態，運動靈活。從第8天開始線蟲開始出現死亡的現象，其運動緩慢，感應外部刺激能力降低，5 μg/mL葛根發酵液延長線蟲壽命效果均優于1 μg/mL(見圖4)。

圖4 葛根發酵液和水提液對線蟲存活率的影響

2.3.2 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲生殖能力的影響

線蟲的產卵能力和線蟲的生長發育狀況有關，通常線蟲長至成蟲才能產卵[17]。葛根發酵液、葛根水提液對線蟲生殖能力的影響如表4所示。實驗選用延長線蟲壽命較為顯著的5 μg/mL為作用濃度，統計線蟲第1天至第5天的產卵量。葛根水提液作用后，線蟲的總產卵量為262.27±17.25個，與對照組相比，產卵量變少，減少率為9.54%，但變化并不顯著。葛根發酵液作用后，線蟲的總產卵量為303.85±20.16個，與對照組相比，增加率為4.8%，產卵量顯著增加(P<0.05)。有衰老理論認為，壽命的延長以生殖減少或喪失為代價[18]，但是葛根發酵液在延長線蟲壽命的同時并未對線蟲的生殖造成損傷。

表4 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲生殖的影響

2.3.3 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲抗熱應激的影響

由圖5和表5可知，葛根水提液作用線蟲后，線蟲的平均耐熱時間為24.03±1.08 h，與對照組相比增加率為5.72%，最長耐熱時間為38.33±3.67 h，最長耐熱時間增加率為11.1%。葛根發酵液作用線蟲后，線蟲的平均耐熱時間為25.57±1.26 h，最長耐熱時間為39.04±2.35 h，與對照組相比，平均耐熱和最長耐熱時間均顯著延長(P<0.05)，分別增加12.49%和13.16%。

表5 葛根水提液、葛根發酵液對線蟲耐熱時間的影響

圖5 熱應激條件下葛根發酵液和水提液對線蟲存活率的影響

2.3.4 葛根發酵液對線蟲衰老相關基因的表達的影響

秀麗隱桿線蟲體內的胰島素信號傳導途徑Insulin/IGF對于線蟲的衰老的調節起關鍵性作用[19]。此通路中的daf-2基因是線蟲衰老的關鍵基因，發育過程中daf-2通過抑制daf-16表達從而影響線蟲的壽命[20-22]。hsp-16.2和sod-3基因是位于daf-16的下游效應因子，在線蟲受到外界熱應激和氧化應激時，daf-16會在這些逆境信號的刺激下迅速向細胞核轉移，進而誘導這些下游效應元件的高表達，以此抵抗外界脅迫造成的壓力[23-25]。由圖6可知葛根發酵液能夠顯著增加線蟲體內daf-16(P<0.05)、hsp-16.2(P<0.01)、sod-3(P<0.01)的表達量，同時下調daf-2表達。由此說明，在熱應激條件下，葛根發酵液作用下的線蟲可能通過抑制daf-2的表達，促進daf-16進入細胞核轉錄，從而促使daf-16下游基因sod-3、hsp-16.2的表達，其中sod-3基因表達量上調顯著，表明線蟲在葛根發酵液的作用下超氧化物歧化酶過量表達，因此能夠更加高效的清除線蟲體內的活性氧和自由基，進而延長線蟲壽命。

圖6 葛根發酵液和對線蟲基因表達的影響

3 討論與結論

葛根作為藥食兩用的中草藥，具有清除自由基、退熱生津、預防心腦血管疾病等功效，其中葛根黃酮類和異黃酮類物質是其主要功效成分，具有良好的抗氧化性。本文通過發酵和水提兩種方式對葛根的活性成分進行提取，比較發現經過發酵得到的提取液中黃酮含量為4.8±0.32 mg/mL，顯著高于水提法得到的黃酮含量3.47±0.23 mg/mL(P<0.01)，發酵法提取獲得的葛根素含量略高、總酚含量略低，但是均無顯著性差異。為進一步對兩種提取液的抗氧化和抗衰老效果進行評估，首先采用3種體外的自由基的清除模型對提取物的抗氧化能力進行檢測，結果顯示6.8%體積濃度的葛根發酵液在總抗氧化能力、對羥自由基和超氧陰離子的清除能力均強于葛根水提液，葛根發酵液抗氧化效果更佳。

線蟲作為衰老的模式生物，廣泛用于中藥提取物延緩衰老的評價。將發酵液與葛根水提液分別作用于秀麗隱桿線蟲，在正常培養條件下與對照組相比，葛根發酵液能夠顯著延長線蟲的壽命(P<0.05)，在熱應激條件下，葛根發酵液培養的線蟲耐熱時間顯著高于對照組(P<0.05)。產卵實驗表明葛根發酵液在延長線蟲壽命的同時不以犧牲線蟲的產卵為代價，其產卵量高于葛根水提液組。基因檢測結果顯示葛根發酵液通過下調促衰老基因daf-2，上調抗衰老基因daf-16、抗氧化基因sod-3以及熱應激基因hsp-16.2的表達，實現對高溫的耐受性以及更高的抗氧化能力，從而實現延長線蟲壽命的作用，葛根發酵液延長線蟲壽命作用機制見圖7。

圖7 葛根發酵液延長線蟲壽命作用機制示意圖

Zhang等[26]將葛根黃酮喂食線蟲的存活率顯著高于對照組。Shao[5]研究顯示葛根水提多糖作用能夠保護線蟲抵御熱應激損傷，同時增強運動能力，延長線蟲壽命。Jeon[27]研究結果表明葛根素對結腸炎小鼠有抗炎和抗氧化功效。由此可知葛根發酵液延緩線蟲衰老的功效是由發酵液中黃酮、多糖、葛根素等多種物質共同作用的結果。結合本課題組此前研究結果[28]，葛根水提液中總糖含量(3.46±0.18 mg/mL)高于葛根發酵液(2.52±0.5 mg/mL)，但是葛根水提液在延緩線蟲衰老效果并不顯著。推斷葛根發酵液中的主要功效成分黃酮在延緩線蟲衰老方面起關鍵作用。

本課題組[28]從生化水平和細胞水平對葛根水提液與葛根發酵液的抗氧化和抗衰老功效進行了檢測，結果顯示葛根發酵液在生化水平具有良好的清除DPPH自由基的效果，并能增加成纖維細胞中抗氧化酶活性，促進膠原蛋白的表達。為了更加全面地評價其抗氧化功效，本篇文章在生化水平補充了葛根兩種提取液對羥自由基、超氧陰離子的清除效果以及總抗氧化能力水平的測試。由于細胞實驗的局限性，為進一步對葛根發酵液的抗衰老效果進行驗證，本篇文章使用衰老模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對象，從動物水平檢測了葛根發酵液延緩線蟲壽命的效果和機制，因此更具備參考價值。結果表明葛根發酵液具有良好的抗氧化效果以及延緩線蟲衰老的作用，其通過調節胰島素信號通路Insulin/IGF中關鍵基因的表達發揮抗衰老功效。以上結果可為葛根發酵液在抗衰老食品、化妝品領域的開發應用提供一定的參考。