膠體金試紙條法快速檢測紡織品中總鉛和總鎘含量

徐建云，黃啟英，劉 娟

(江蘇省紡織產品質量監督檢驗研究院，江蘇 南京 210007)

近年來，紡織品的綠色安全越來越受到消費者的關注，紡織品中鉛(Pb)、鎘(Cd)元素超標案例不斷被報道。紡織品與消費者密切接觸，其表面殘留的重金屬元素Pb、Cd遷移會損害人體健康。紡織品是人體攝入Pb、Cd元素的主要來源之一，檢測紡織品中的Pb、Cd含量是控制人體Pb、Cd攝入量的重要預防措施。目前國內普遍依據GB/T 30157—2013《紡織品 總鉛和總鎘含量的測定》對紡織品進行測試[1]，主要采用電感耦合等離子體發射光譜儀進行測試，該方法與石墨爐-火焰原子吸收分光光度法為經典的兩種重金屬檢測方法，除此之外，還有電感藕合等離子體質譜法、X射線熒光光譜法、基于顯色劑的分光光度法、電化學分析方法、高效液相色譜法等[2-5]。目前紡織品中重金屬Pb、Cd元素的檢測方法存在檢測過程中依賴大型儀器設備、設備昂貴、方法耗時、儀器使用和維護成本高、檢測人員需具備一定的專業知識等問題，導致上述傳統檢測方法很難在實驗室推廣，更不適合于現場快速檢測[7-9]。因此，建立一種操作簡便、現場快速檢測紡織品中有害重金屬元素的方法是當今行業內的迫切需求[10-11]。

膠體金試紙條法是一種基于金納米粒子(AuNPs)標記的抗原抗體反應的重金屬Pb、Cd元素檢測技術，該類試紙條具有無背景干擾、肉眼易識別、靈敏度高、操作簡單、攜帶方便、試劑用量少、無需任何儀器設備、成本低等優點，有望真正實現現場快速檢測，是目前常用的重金屬Pb、Cd元素快速檢測方法之一。作者以Pb、Cd單克隆抗體為基礎，研制出一種用于現場快速檢測紡織品中總Pb、總Cd含量的膠體金試紙條，并采用該膠體金試紙條對紡織品中總Pb、總Cd含量進行篩檢。

1 實驗

1.1 試樣與試劑

純棉針織面料：江蘇常熟市富康達針紡織品有限公司產。

Pb、Cd單克隆抗體：實驗室自制；羊抗小鼠(IgG)：長春鼎國生物技術有限公司產；氯金酸(HAuCl4)、牛血清蛋白(BSA)：美國Sigma公司產；檸檬酸三鈉、氯化鈉、過氧化氫、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、硝酸、磷酸氫二鈉二水化合物、磷酸二氫鉀：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產；玻璃纖維素膜：芬蘭Ahlstrom公司產；硝酸纖維素膜：德國Sartorius公司產；PVC板、試紙卡、吸水紙：上海杰一生物科技有限公司產；Pb、Cd單元素標準溶液：濃度為100 μg/mL，中國計量科學研究院產；氬氣：純度大于99.99%，南京紅健氣體有限公司產；超純水：自制。

1.2 儀器

Avio200電感耦合等離子體發射光譜儀：美國鉑金埃爾默公司制；Cary 60紫外可見分光光度計：美國安捷倫公司制；高速離心機：德國Sigma公司制；BP221S 型分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司制；METTLER TOLEDO Seven Compact pH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司制；恒溫磁力攪拌器、SHZ-88A 恒溫水浴振蕩器：江蘇太倉實驗設備廠制；超純水制備裝置：美國Millipore公司制；CEM MARS6微波消解儀：美國CEM公司制；HM3030劃膜噴金儀：上海金標生物科技有限公司制。

1.3 膠體金探針的制備

1.3.1 AuNPs的制備與表征

參照文獻[12]，通過熱還原HAuCl4獲得檸檬酸鈉保護的AuNPs。在快速攪拌的情況下，將15 mL 38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液立即加入到煮沸的150 mL 1.0 mmol/L HAuCl4溶液中，并保持沸騰15 min；連續攪拌溶液冷卻至室溫，然后通過0.2 μm濾膜過濾，得到AuNPs。

1.3.2 Pb及Cd單克隆抗體標記膠體金探針的制備與純化

膠體金探針是分別用Pb、Cd單克隆抗體修飾直徑為15 nm的AuNPs來制備。通過滴加碳酸鉀溶液調節AuNPs分散液的pH值為8.5，然后取1 mL AuNPs分散液分別與等量Pb、Cd單克隆抗體 (5 μL, 100 nmol/L)混合，逐滴加入抗體溶液，攪拌10 min，靜置10 min，再向管內加入100 μL質量分數為10%的PEG溶液，攪拌20 min，混勻靜置老化40 h；在轉速10 000 r/min下離心30 min，以去除過量的試劑；通過50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)對沉淀物連續3次離心-分散進行洗滌；最終分散在含有0.1 g/L PEG 的50 mmol/L PBS溶液中(pH值為7.5)，獲得Pb及Cd單克隆抗體標記膠體金探針，備用。

1.4 膠體金試紙條的制備

1.4.1 試樣墊及結合墊的制備

分別取玻璃纖維素膜將其切割成2.0 cm×5.0 cm浸泡于pH值為7.5的PBS溶液中4 ℃過夜，37 ℃風干制成試樣墊、結合墊，于4 ℃密封保存備用。

1.4.2 硝酸纖維素膜的包被加工

取硝酸纖維素膜1條，并切割成2.5 cm×5.0 cm，分別將1.0 mg/mL完全檢測抗原、羊抗小鼠IgG加入洗凈的劃膜噴金儀噴頭，固定檢測線和質控線位置，進行噴膜，待硝酸纖維素膜風干，4 ℃密封保存備用。

1.4.3 膠體金結合墊的制備

將制備好的Pb及Cd單克隆抗體標記膠體金探針分別包被于玻璃纖維膜上，風干，得到膠體金結合墊，4 ℃密封保存備用。

1.4.4 吸收墊的制備

取吸水紙將其切割成2.0 cm×5.0 cm，制備吸收墊，4 ℃密封保存備用。

1.4.5 膠體金試紙條的組裝

膠體金試紙條的組裝過程見圖1。在PVC底板上依次將試樣墊、膠體金結合墊、包被有抗原和IgG的測試線和控制線的硝酸纖維素膜及吸收墊進行組裝，其中，硝酸纖維素膜置于底板中部，結合墊一邊緣搭于硝酸纖維素膜靠近檢測線一端，另一端稍重疊于PVC板上，試樣墊一端繼續疊加在該端膠體金結合墊，試樣墊另一端貼合于PVC板上，則兩端分別疊加于硝酸纖維素膜、PVC底板上，吸水墊始端疊加于硝酸纖維素膜另一端，吸水墊末端與底板末端對齊，在保護膜上印有樣液流動箭頭指向標記，該保護膜覆蓋在試樣墊上，最終將組裝好的膠體金試紙條切割成4 mm 寬的試紙條，4 ℃密封保存備用。

圖1 膠體金試紙條組裝示意Fig.1 Schematic diagram of colloidal gold test strip1—試樣墊；2—連接墊/膠體金墊；3—質控線；4—吸收墊；5—背襯(底板)；6—檢測線；7—硝酸纖維素膜

1.5 樣液的制備

1.5.1 試樣前處理

將純棉針織面料試樣剪碎至5 mm×5 mm以下，稱取 0.20 g置于聚四氟乙烯消解容器中；加入7 mL濃硝酸、3 mL雙氧水，待試樣和濃硝酸在室溫下反應完全后，將消解容器密封并放置到微波消解儀中，15 min內升溫至(180±5) ℃，并在(180±5) ℃ 保持 6 min，取出消解罐，打開前應先在通風柜中將微波消解罐靜置并冷卻到室溫或冷卻30 min；取出聚四氟乙烯消解罐在加熱板上于100 ℃加熱30 min趕酸，用一級水分 3 次淋洗，將消解溶液轉移至25 mL容量瓶中，用一級水定容至刻度，搖勻，獲得樣液；用質量分數1%的氫氧化鈉溶液調節樣液pH值為5.5，經無機濾膜過濾后，用于測定紡織品中總Pb、總Cd含量。

1.5.2 0.02 mol/L EDTA溶液的配制

在天平上準確稱取3.80 g EDTA，溶于100 mL去離子水中，微熱溶解后，轉移到500 mL容量瓶中，再加入去離子水定容搖勻。

1.5.3 待測液的制備

將含有不同質量濃度的Cd、Pb標準溶液、樣液分別與過量的EDTA螯合溶液(體積比1:1，EDTA過量)混合，制備Pb-ITCBE、Cd-ITCBE標準待測液和試樣待測液。

1.6 試紙條的應用及方法評價

1.6.1 膠體金試紙條的應用

將待測液滴于試樣墊中，待測液向吸收墊方向移動，到達結合墊時，會與膠體金復合物結合，待測液中Pb、Cd離子越多，到達檢測線時，與檢測線上的完全檢測抗原結合的金標抗體越少，檢測線上截留的金標抗體越少，顯色越淺，反之，待測離子越少，檢測線紅顏色越深；待測液到達質控線時，無論樣液里是否含有待測Pb、Cd離子，膠體金復合物均會與質控線上的IgG結合，質控線顯紅色，如果質控線不顯色，則測試結果為無效。當測定有效進行時，控制線(C線)一直會顯示紅色；若不顯色，則測試無效。

當待測液中Pb/Cd-ITCBE質量濃度小于最低檢出限濃度時，膠體金結合墊中的單克隆抗體膠體金復合物與T線上Cd完全檢測抗原結合，檢測線顯紅。

1.6.2 方法檢出限的測定

分別將100 μg/mL Pb或Cd的標準溶液，用PBS配制成Cd濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0 μg/L和Pb濃度為5.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0 μg/L的系列標準溶液。分別取1 mL與EDTA溶液混合反應(體積比1:1，EDTA過量)，最終制備系列標準樣液。取上述100 μL樣液分別滴加至膠體金試紙條的試樣墊上，等待3～5 min后，觀察檢測線、控制線顯色情況，記錄目測檢測線有顯色時對應標準樣液的濃度。以確定試紙條對待測重金屬元素的檢出限，進一步推算出試紙條對紡織品中總Cd、總Pb含量的檢出限。

1.6.3 準確性評價

選擇砷(As)、銻(Sb)、鎳(Ni)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)6種金屬離子，分別配成濃度為30 μg/L的水溶液，用試紙條進行檢測。

1.6.4 重現性及穩定性評價

將試紙條放入密封盒中，加入干燥劑，分別于4 ℃、室溫和37 ℃保存1，5，7，8，10，15，30，50，60，70，80 d。取出試紙條，分別滴加濃度為50.0 μg/L的Cd或Pb溶液，考察試紙條在不同存儲溫度及不同存儲時間下的顯色反應。

2 結果和討論

2.1 AuNPs的表征

采用紫外分光光度計在波長(λ)400～600 nm掃描膠體金溶液，得到其吸光度(Abs)。從圖2可以看出，膠體金溶液的最大吸收峰在 523 nm處，無雜峰，且峰寬較小，表明制備的AuNPs顆粒分布均勻。

圖2 膠體金溶液的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of colloidal gold solution

膠體金溶液的透射電鏡掃描結果見圖3。

圖3 膠體金溶液的透射電鏡照片Fig.3 Transmission electron microscope photograph of colloidal gold solution

從圖3可以看出，AuNPs顆粒大小均一，經計算，AuNPs直徑在15 nm左右，適合單克隆抗體標記，可在試紙條檢測線上產生可目測的強烈信號。AuNPs顆粒表面負電荷與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。AuNPs對蛋白質有很強的吸附功能，蛋白質等高分子被吸附到AuNPs顆粒表面，無共價鍵形成，標記后大分子物質活性不發生改變。

2.2 抗體標記條件優化

用50 mmol/L 的磷酸氫二鈉溶液調節膠體金溶液的pH值分別至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0；分別取1 mL膠體金溶液，并加入50 μL標記抗體，混勻，靜止10 min，再分別加入50 μL 質量分數20%的NaCl溶液，混勻后靜止3 h，測定單抗修飾膠體金溶液在吸收波長570 nm處的Abs。從圖4可以看出，在pH值為7.5及8.5時，膠體金溶液為透明紅色液體，Abs最大，之后出現顯著下降，在其他pH值時，AuNPs顆粒出現團聚變藍現象，說明在pH值為7.5及8.5時，膠體金分別與Pb及Cd單抗的吸附較好。在pH值接近于蛋白質等電點或略偏堿性時，蛋白質所處溶解狀態最適合偶聯，蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。

圖4 單抗修飾膠體金溶液的Abs隨pH值的變化Fig.4 Change of Abs with pH value of monoclonal antibody modified colloidal gold solution ●—Pb單抗；■—Cd單抗

2.3 Pb及Cd單克隆抗體用量

分別取10份pH值為7.5及8.5的1 mL膠體金溶液，分別加入20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 μL的 Pb及Cd單克隆抗體進行標記，在振蕩器上振蕩混勻10 min，靜置10 min，再分別加入50 μL質量分數20%的NaCl溶液，混勻10 min，測定吸收波長570 nm處單抗修飾的膠體金溶液的Abs。從圖5可以看出：隨著Pb及Cd單克隆抗體加入量增大，溶液的Abs先增大后降低；在Pb及Cd單克隆抗體加入量分別為50 μL及45 μL時，單抗修飾膠體金溶液的Abs最大；繼續添加Pb及Cd單克隆抗體，膠體金溶液的Abs下降，膠體金溶液保持穩定紅色。因此， Pb、Cd抗體較佳用量分別為50 μL及45 μL。

圖5 膠體金溶液的Abs隨Pb及Cd單克隆抗體用量的變化Fig.5 Change of Abs of colloidal gold solution with amounts of Pb and Cd monoclonal antibodies ■—Pb單抗；●—Cd單抗

2.4 方法評價

2.4.1 方法檢出限

從表1、表2可知：分別用Cd質量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0 μg/L和Pb質量濃度為5.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0 μg/L的標準溶液與EDTA進行螯合，并用Pb及Cd試紙條檢測，等待3～5 min，部分試紙條檢測線、質控線顯紅色，Pb及Cd標準溶液質量濃度為分別為40 μg/L及5.0 μg/L時，試紙條檢測線目測淺紅色，質控線顯紅色，判為假陰性；低于此濃度，C 線顯色，T 線目測顯紅色，初步確定為陰性；分別用高于40 μg/L及5.0 μg/L的Pb及Cd標準溶液進行試紙條檢測時，T線不顯色，C線為紅色條帶，判為陽性。因此，分別選擇40 μg/L及5.0 μg/L為Pb及Cd試紙條的檢出限，折算到紡織品試樣中，Pb及Cd試紙條對Pb及Cd的檢出限分別為5.0 mg/kg及0.625 mg/kg。國家強制性標準GB 31701—2015《嬰幼兒及兒童紡織產品安全技術規范》規定紡織品中總Cd含量不超過100 mg/kg、總Pb含量不超過90 mg/kg的限量值要求，利用制備的Pb及Cd試紙條測定紡織品中總Pb、總Cd含量，可以滿足日常檢測初篩需求。

表1 Pb試紙條對不同濃度的Pb的靈敏度分析Tab.1 Sensitivity analysis of Pb test strip to Pb of different concentrations

表2 Cd試紙條對不同濃度的Cd的靈敏度分析Tab.2 Sensitivity analysis of Cd test strip to Cd of different concentrations

2.4.2 方法準確性

使用Pb及Cd試紙條檢測其他金屬離子，進行選擇性實驗，驗證試紙條的準確性，結果見表3。

表3 試紙條對Pb離子及Cd離子的選擇性Tab.3 Selectivity of Pb and Cd ions by strips

從表3可知：采用Pb試紙條分別對含As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu、Pb離子的溶液進行測試，滴加含有As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu離子的溶液時，Pb試紙條呈陰性，而滴加含有Pb離子的溶液時，Pb試紙條呈陽性，As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu離子對Pb試紙條測試不會造成干擾；采用Cd試紙條測試，滴加含有As、Co、Pb、Cr、Ni、Sb、Cu離子的溶液時，Cd試紙條呈陰性，而滴加含有Cd離子的溶液時，Cd試紙條呈陽性，As、Co、Pb、Cr、Ni、Sb、Cu離子對Cd試紙條測試不會造成干擾。因此，該方法用于測定紡織品中總Pb、總Cd含量時都無假陰性現象，確保了該方法的準確性。

2.4.3 試紙條穩定性

試紙條在不同存儲溫度及不同存儲時間下的顯色反應結果表明，結合墊上的Pb及Cd金標記抗體在4 ℃下分別保存70 d及50 d內，結合墊上的金標探針仍可以完全釋放，沒有出現拖尾及條帶中空現象，檢測線和控制線顯色情況和保存前一致；結合墊上的Pb及Cd金標記抗體在室溫或37 ℃條件下僅放置10 d，試紙條的活性有所下降。由此可見，本方法的Pb及Cd試紙條具有較好的穩定性。

3 結論

a.建立了一種基于Pb、Cd單克隆抗體的膠體金試紙條方法，可用于快速檢測紡織品中總Pb、總Cd含量。

b.Pb及Cd試紙條對紡織品中總Pb、總Cd含量的檢出限分別達到5.0 mg/kg 和0.625 mg/kg，僅需3～5 min 即可便捷實現試樣中總Pb、總Cd含量的目測初篩判定；其靈敏度和穩定性均能滿足實際試樣的測試要求。

c.該方法操作方便、準確度高，對Pb、Cd離子的檢測具有良好的選擇性，適用于紡織品現場快速、批量篩檢。