基于腦腸肽CCK-8研究涼血通瘀方對急性腦出血模型大鼠的神經保護作用機制

李建香 劉云芳 王君君 顧 恒 趙 楊 過偉峰

（1.南京中醫藥大學附屬南京中醫院，江蘇南京 210022；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇南京 210023）

腦出血是一種致死性腦血管病，急性期病死率高達35%~52%，幸存者常遺留明顯殘障[1]。研究表明，長期以來采用的止血、脫水、外科手術等方法未能明顯降低本病的致殘率和死亡率[2]。實踐證明，通腑瀉熱法治療中風實證，可以開竅醒腦，減輕腦損傷[3]。前期研究證實，由國醫大師周仲瑛創制的涼血通瘀方，治療急性腦出血臨床療效顯著[4-6]。本方化裁自桃核承氣湯和犀角地黃湯，有通腑瀉下祛瘀之功，使氣血得以敷布，病情得有轉機，達到“上病下取”“從腸治腦”的目的。

前期研究發現，涼血通瘀方可以增加排便，改善腸道功能，調節腸-腦軸，影響腦腸肽[7]。八肽膽囊收縮素（cholecystokinin-8，CCK-8）作為一種典型腦腸肽，廣泛分布于胃腸道和中樞神經系統，是研究腸-腦軸的重要切入點。現代研究證實，CCK-8是一種內源性神經保護因子，具有神經保護和修復作用，可促進神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的合成，改善氧化應激狀態[8-9]。

課題組臨床研究發現，涼血通瘀方可通過提高神經營養因子、減輕氧化應激以改善腦出血患者癥狀和體征[6]。本研究以腦出血模型大鼠為研究對象，觀察給予涼血通瘀方干預后大鼠腦組織NGF、BDNF以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，以明確涼血通瘀方的神經保護作用，通過檢測大鼠腦組織和腸組織CCK-8的含量以探討本方神經保護作用的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，6~8周齡，體質量（200±20）g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，光照黑暗交替，飼養室溫度20~25 ℃，濕度40%~60%。適應性飼養7 d。本實驗通過南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查（批號：201805A026）。

1.2 藥物 涼血通瘀方（大黃10 g、水牛角30 g、生地黃20 g、赤芍15 g、牡丹皮10 g、石菖蒲10 g）中藥飲片由南京中醫藥大學附屬南京中醫院藥學部提供。水牛角先煎20 min，加入生地黃、赤芍、牡丹皮、石菖蒲，煮沸10 min，加入大黃再次煮沸10 min，倒出藥液，再加水煮沸10 min，過濾合并2次濾液，濃縮至1.2 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器 NGF抗體（批號：bs-0067R）、檸檬酸鈉抗原修復液（批號：C02-02001）、生物素標記的羊抗兔IgG二抗（批號：bs-0295G）、DAPI（批號：C02-04002）、DAB試劑盒（批號：C02-04001）、蘇木素-伊紅染色試劑盒（批號：C02-04004）購自北京博奧森生物技術有限公司；BDNF抗體（批號：ab108319）、GAPDH抗 體（批 號：ab181602）、二 抗（批號：ab6722）購自Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010）、SOD試劑盒（批號：S0101）、MDA試劑盒（批號：S0130）購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號：E12186R-1）購自南京奧青生物技術有限公司。

腦立體定位儀（加拿大David Kopf Instruments公司，型號：990-685），注射泵控制器（中國保定蘭格恒流泵有限公司，型號：TJ-1A），多功能開顱鉆（日本Makita公司，型號：6222D），生物顯微鏡（德國萊卡公司，型號：DM2500型），超靈敏化學發光成像儀（美國GE公司，型號：LAS4000mini），酶標儀（美國PerkinElmer公司，型號：EnSpire）。

2 實驗方法

2.1 模型制備 采用改良自體血注入法制作腦出血大鼠模型[10]。麻醉動物，將其俯臥固定于腦立體定向儀，頭部正中切開，確定前囟點，選擇前囟點右側中線旁開3 mm、冠狀縫前0.2 mm處，定位尾狀核，顱骨鉆孔；反轉暴露尾根腹側，分離尾動脈，微量進樣器刺入，抽取50 μL血液；微量進樣器固定于立體定位儀，于鉆孔處緩慢進針6 mm；以5 μL/min速度注入血液，注射結束采用二次退針法，骨蠟封閉顱孔。麻醉蘇醒后，使用Longa五級評分法對造模大鼠進行評分，1~3分的動物為造模成功。

2.2 分組與給藥 SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為正常組、假手術組、造模組。造模組按2.1項下方法造模，選取30只造模成功的大鼠隨機分為模型組、涼血通瘀方組，每組15只。假手術組大鼠處理方法同造模組，以微量進樣器空針置入尾狀核，不注射血液，選術后存活的大鼠15只入組。正常組亦取15只入組。涼血通瘀方組以15 g/kg給予涼血通瘀方煎劑灌胃，正常組、假手術組、模型組灌胃等量生理鹽水，根據前期給藥后1 d、3 d、5 d三個時間點的實驗結果[7]，本研究各組均每日灌胃1次，連續3 d。涼血通瘀方劑量根據人體和動物的等效劑量進行換算。既往研究采用涼血通瘀方高、中、低劑量分別給藥，發現中劑量對急性腦出血動物腦功能改善效果最好[11]，因此本研究選擇15 g/kg劑量進行實驗。

2.3 標本采集與處理 末次給藥后，模型組、涼血通瘀方組大鼠采用Longa五級評分法評價神經功能缺損程度。評分完成后，各組隨機取5只大鼠，麻醉后開胸，暴露心臟，心內依次灌注生理鹽水、4%多聚甲醛，取出血灶邊緣腦組織，石蠟包埋，用于檢測腦組織NGF表達。各組剩余10只大鼠處死后取出血灶邊緣腦組織和回盲部腸組織，-80 ℃保存，其中隨機取5只大鼠腦組織進行BDNF蛋白檢測，取全部10只大鼠腦組織進行SOD、MDA含量檢測，取全部10只大鼠腦組織和腸組織進行CCK-8含量檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 Longa五級評分法評價神經功能缺損程度 分別于造模成功后、灌胃3 d后對模型組與涼血通瘀方組進行神經功能缺損程度評價。采用Longa五級評分法，具體標準如下：0分，無體征；1分，不能完全伸直前肢；2分，一側肢體癱瘓，有追尾現象；3分，不能站立或者打滾；4分，無自發性活動，有意識障礙。由統一培訓的研究人員對大鼠進行評分，每只動物重復評價3次，每次間隔1 min，取平均值。

2.4.2 免疫組化法檢測腦組織NGF表達 取各組5只大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟脫水，抗原修復，血清封閉，一抗、二抗孵育，顯色，顯微鏡下觀察，適時終止；蘇木素復染，脫水，封片；生物顯微鏡觀察（×400），以胞漿或胞核棕黃色顆粒為陽性染色。選取血腫周圍腦組織3個視野。應用Image pro plus 6.0軟件分析圖像，得到累積光密度值（IOD）和像素面積（Area），以IOD/Area值為平均光密度值。

2.4.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測腦組織BDNF蛋白表達 取各組5只大鼠腦組織，加入蛋白裂解液，球磨儀勻漿。充分裂解后，4 ℃離心（離心半徑10 cm，14 000 r/min，5 min）2次，取上清。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書配置，測吸光值，計算樣本蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法以25 V轉膜20 min，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉，室溫慢搖2 h。5%脫脂奶粉配制一抗，抗體濃度為1∶1000，置入一抗，4 ℃過夜，配制二抗，濃度為1∶5000，室溫震蕩孵育2 h，吸棄二抗稀釋液，TBST洗膜3次，每次5 min。根據說明書配制顯影液6 mL，置入化學發光成像儀內曝光。所得圖像經Image J處理，檢測各組圖像灰度值。

2.4.4 生化法檢測腦組織SOD、MDA含量 取各組10只大鼠腦組織，加入裂解液研磨成勻漿，4 ℃離心（離心半徑10 cm，3000 r/min，10 min），取上清液。采用WST-8法檢測SOD含量，按照說明書配制SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液和反應啟動工作液，于96孔板加樣顯色，記錄酶標儀上吸光度值；采用硫代巴比妥酸反應法檢測MDA含量，按照說明書配制MDA檢測工作液和標準品，于96孔板加樣顯色，記錄酶標儀上吸光度值。

2.4.5 ELISA法檢測腦組織和腸組織CCK-8含量 取各組10只大鼠腦組織和腸組織，加入裂解液RIPA（每100 mg組織中加入1 mL RIPA），研磨勻漿，4 ℃離心（離心半徑10 cm，3000 r/min，10 min），取上清液，參照說明書操作，酶標儀上測吸光度，計算濃度。

2.5 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行分析。計量數據以（x-±s）表示。兩組間比較采用 t 檢驗；多組間比較采用方差分析，方差齊采用LSD法進行多重比較，方差不齊采用Dunnett’s T3法進行多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 模型組與涼血通瘀方組大鼠Longa評分比較 模型組和涼血通瘀方組大鼠造模成功后Longa評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；2組大鼠灌胃3 d后Longa評分均顯著低于造模成功后（P＜0.01）；灌胃3 d后，涼血通瘀方組Longa評分顯著低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 模型組與涼血通瘀方組大鼠造模成功后、灌胃3 d后Longa評分比較（x-±s） 單位：分

3.2 各組大鼠腦組織NGF表達比較 與正常組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織NGF平均光密度值顯著降低（P＜0.01），涼血通瘀方組平均光密度值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織NGF平均光密度值顯著升高（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織NGF表達（×400）

表2 各組大鼠腦組織NGF平均光密度值比較（x-±s）

3.3 各組大鼠腦組織BDNF蛋白表達水平比較 與正常組比較，假手術組和模型組大鼠腦組織BDNF蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），涼血通瘀方組表達水平顯著升高（P＜0.05）；與假手術組和模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織BDNF蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腦組織BDNF蛋白表達

表3 各組大鼠腦組織BDNF蛋白表達水平比較（x-±s）

3.4 各組大鼠腦組織SOD和MDA含量比較 與正常組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織SOD含量顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；涼血通瘀方組大鼠腦組織SOD、MDA含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織SOD含量顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠腦組織SOD和MDA含量比較（x-±s） 單位：μmol/L

3.5 各組大鼠腦組織和腸組織CCK-8含量比較 與正常組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織、腸組織CCK-8含量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），涼血通瘀方組含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀方組大鼠腦組織、腸組織CCK-8含量均顯著升高（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠腦組織和腸組織CCK-8含量比較（x-±s） 單位：pg/mL

4 討論

腦出血屬中醫學“中風”范疇，顱內血腫形成后繼發腦水腫、腦組織受壓甚至腦疝等，導致神經元不可逆損傷，患者常遺留明顯的神經功能缺損癥狀。如何保護急性腦出血受損周邊組織、促進神經修復是亟待解決的問題。目前相關神經保護劑尚未受到廣泛認可，需要進行高質量、大樣本的隨機對照試驗以進一步證實[12，2]。

通腑瀉熱法治療中風始于金元，后世廣泛應用。通腑瀉熱，“釜底抽薪”，腑氣暢通，往往神明清爽，病情逆轉。急性腦出血常合并陽明腑實證，風火痰瘀內結，氣機逆亂，通降失司，積滯內停；腸腑濁氣壅塞，火升陽亢，上擾清明。現代研究發現，腦出血后中樞神經受損，自主神經功能紊亂，胃腸蠕動緩慢，長期臥床、脫水治療，加重腸道缺水；胃腸毒素蓄積，透過腸黏膜屏障，進入血液；胃腸運動遲緩可增加腹壓，加重顱內壓升高[13]。通腑瀉熱以開竅醒腦，體現了“腦病治腸”的治療學理念。

國醫大師周仲瑛根據多年臨證經驗提出，對于急性中風邪實證，臨床可應用涼血通瘀法，以下為度，達到“上病下取”“從腸治腦”的目的。涼血通瘀方具有涼血散瘀、通腑瀉熱之功效。方中大黃通腑瀉熱、逐瘀祛邪，水牛角清熱瀉火、涼血寧血，二者合用阻斷血熱煎熬成瘀，防止瘀熱生風化痰；生地黃滋陰養血、涼血清熱；赤芍、牡丹皮涼血散瘀；石菖蒲走竄上行，直達巔頂。

本研究采用改良自體血注入法制作腦出血大鼠模型，造模效果穩定。前期研究表明，假手術組會出現因手術造成的腦組織輕微損傷，與正常組的實驗結果可能存在一定程度的差異，故本研究同時設立正常組和假手術組以幫助驗證手術操作是否會引發實驗數據的差異。結果表明，與正常組比較，假手術組大鼠腦組織NGF表達和SOD、MDA含量，腦、腸組織CCK-8含量差異無統計學意義（P＞0.05），腦組織BDNF蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

本研究觀察了涼血通瘀方對急性腦出血大鼠的神經保護作用，并探索其機制。NGF和BDNF是中樞神經系統重要的神經營養因子，對神經元生長分化發揮關鍵作用，與腦卒中密切相關，可保護受損神經元[14-15]。NGF可促進腦出血后軸突再生，激活血腫灶周圍神經干細胞增殖，促進周圍組織新生血管形成[16]。BDNF能減輕腦出血神經元受損死亡，促進神經元分化生長和卒中后的運動、感覺康復[17]。本研究結果表明，涼血通瘀方可顯著升高急性腦出血模型大鼠腦組織NGF和BDNF蛋白表達，表明本方可促進神經元的激活，具有神經保護作用。氧自由基導致腦出血后腦損傷，誘導神經元凋亡。SOD主要防御超氧陰離子自由基的強氧化，對抗氧自由基損傷。急性腦出血后周圍組織水腫缺血缺氧、繼發性顱內壓增高、腦組織代謝紊亂等，催化產生大量氧自由基，產生脂質過氧化物MDA，破壞細胞膜的生物結構[18-19]。本研究發現涼血通瘀方可升高急性腦出血模型大鼠腦組織SOD含量，降低MDA含量，減輕腦出血后氧化應激。

現代腸-腦軸理論的提出、腦腸互動學說的發展為研究腦腸相關疾病奠定了基礎。腦腸肽是腦腸共有激素，可調節腦腸互動，CCK-8以神經遞質形式參與腦出血的發生發展[20]，具有神經保護作用。研究發現，CCK-8可促進NGF合成釋放，重建受損神經元，協助軸突生長，參與神經元存活再生；改善神經生長微環境，拮抗神經元凋亡，促進神經細胞功能恢復；同時提升SOD活力，降低MDA濃度，提高清除氧自由基的能力[21-23]。本研究結果表明，涼血通瘀方可顯著升高急性腦出血模型大鼠腦、腸組織CCK-8含量，這一作用可能是其發揮神經保護作用的機制之一。

綜上所述，涼血通瘀方對急性腦出血模型大鼠具有神經保護作用，其機制可能與增加腦、腸組織CCK-8的含量有關。未來可進一步研究本方調節腸道動力功能或腸道微生物變化的作用機制，以及通過迷走神經中樞途徑和腸-肝循環外周途徑影響中樞神經系統的作用機制。