銅代謝相關蛋白及關聯疾病研究進展

王天城(綜述)， 楊旭龍， 湯依萍， 彭青和， 周安， 吳鵬(審校)

銅是人類肝臟中含量較高的必需過渡金屬，僅次于鐵和鋅，是體內多數氧化酶的輔基。銅離子作為輔助因子傳遞給銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)、細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)、凝血因子Ⅴ和Ⅰ等，參與細胞能量代謝、抗氧化、神經遞質形成等重要生命活動[1]。體內銅的含量需要維持相對穩定，銅代謝發生異常會引發一系列的機體功能障礙，引起嚴重的臨床癥狀。

銅進入機體后，由小腸吸收，轉運至肝臟內代謝，然后通過血液運輸至各組織器官。以細胞利用銅離子為例，還原成一價的銅離子由銅轉運蛋白(copper transporter 1，Ctr1)轉運至細胞內，二價金屬轉運蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)也可吸收少數的Cu2+。胞內銅通過超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白(copper chaperone of superoxide dismutase，CCS)插入SOD1、通過COX17傳遞到線粒體中的COX合成物1/2(synthesis of cytochrome C oxidase 1/2，SCO1/2)后整合至COX中、通過抗氧化蛋白1(anti-oxidant 1，ATOX1)轉運到反面高爾基體管網狀結構(trans-Golgi network，TGN)上的銅轉運ATP酶α肽(ATPase Cu2+transporting alpha polypeptide，ATP7A)和銅轉運ATP酶β肽(ATPase Cu2+transporting beta polypeptide，ATP7B)。銅代謝結構域包含體1(copper metabolism mouse U2af1-rs1 region 1，COMMD1)參與ATP7B的細胞內運輸，并且是該轉運體從質膜向TGN逆行運動所必需的。適配器蛋白復合體1(adaptor protein complex 1，AP-1)調節ATP7A和ATP7B在細胞中的定位(圖1)。近年來，隨著分子生物學和遺傳學的發展，銅代謝的基礎與臨床研究取得了一定進展。本研究將從銅代謝相關基因、蛋白結構、生理功能及關聯疾病作一綜述。

圖1 銅代謝相關蛋白模式圖Fig.1 Diagram of copper metabolism related proteins

1 腸道吸收銅代謝相關蛋白

1.1 Ctr1 Ctr1是一種由SLC31A1基因編碼的對Cu2+具有高親和力的轉運蛋白，主要定位在細胞膜上[2]。人類銅轉運蛋白1(human copper transporter 1，hCtr1)含有190個氨基酸殘基，其分子結構主要由4個部分構成：(1)1個暴露在膜外的糖基化N-末端結構；(2)3個單環跨膜區域結構；(3)1個在第一和第二跨膜結構間起連接作用長度可變的細胞內環形結構；(4)1個膜內的C-末端結構。Ctr1蛋白暴露在膜外的糖基化N-末端，含有較豐富的蛋氨酸和組氨酸，具有交纏結構，有利于Cu2+的結合。

人體內銅的吸收主要依賴位于腸道細胞頂膜和大多數組織中的Ctr1，由于Ctr1只能對Cu+進行轉運，所以Cu2+會先還原成Cu+，這一過程可能是金屬還原酶、維生素C及DCYTB介導的。Cu+在富含蛋氨酸和組氨酸的N-末端停靠點通過Ctr1寡聚體對稱的通道狀結構進入細胞內[3]。Ctr1的N-端富含組氨酸的結構域，對Cu2+有著很高的親合度并且參與Ctr1對銅的攝取。Cu+借助Ctr1蛋白從膜外主動轉運至膜內后，作為輔助因子在細胞內相關蛋白間遷移。自然選擇進化出了一套十分嚴密的調控網絡，通過一系列蛋白確保Cu+安全到達正確的靶點而不產生危害[4]。目前研究發現，hCtr1蛋白捕獲的Cu+主要傳遞至3個靶向蛋白:線粒體中的COX、細胞質中的SOD1和TGN。在動物模型研究中發現，Ctr1蛋白發生異常會導致胚胎死亡，致病基因為SLC31A1，但人類中未見報道[5]。

1.2 ATP7AATP7A基因定位于Xq21.1，含有23個外顯子，是編碼1 500個氨基酸的銅轉運p型ATP酶。ATP7A的蛋白結構包括3個部分：N-端6個金屬結構域(metal-binding domain 1～6，MBD1～MBD6)、8個跨膜區域(transmembrane domain 1～8，TMD1～TMD8)以及C-端區域[6]。TMD1～TMD8組成ATP7A蛋白的銅跨膜運輸通道，TMD4和TMD5之間為活化區域(phosphatase domain，A-domain)，TMD6與TMD7之間存在一個磷酸化區域(phosphorylation domain，P-domain)和核苷酸結合區域(ATP-binding domain，N-domain)。ATOX1傳遞的Cu+可與MBD1～MBD6結合，MBD通過其激活啟動泵送[7]。MBD1～MBD4主要與A-domain相互作用，MBD5～MBD6則調節酶與銅的親和力，每個MBD都有1個由柔性環連接的緊湊折疊使其行動[8]。ATP7A羧基末端存在保守的2個亮氨酸殘基，ATP7A在細胞中的內吞和外排作用與之相關。

ATP7A定位于TGN上，主要功能為調控Cu2+運輸、排泄以及催化ATP分解。除肝臟外的組織中，銅通過ATP7A離開細胞質并穿過基底外側膜[7]。正常生理情況下，銅會被泵入分泌途徑，ATOX1將銅運輸至高爾基體，并通過ATP7A轉運至TGN，促進銅酶的合成[9]。當胞內銅水平偏高時，ATP7A會重新定位，從而泵出多余的銅[8]，高爾基體上ATP7A遷徙到細胞膜上，Cu2+與其N-端的金屬結合位點結合后，ATP與ATP激酶完成結合并生成ADP。此時Cu2+轉移至酶核心，最后通過去磷酸化將多余的銅排出細胞，當胞內銅穩態恢復后ATP7A重返至高爾基體上[9]。

ATP7A基因缺陷導致X連鎖疾病：枕角綜合征(OMIM 304150)、脊髓性肌萎縮遠端X連鎖3(SMAS3，OMIM 300489)和門克斯病(OMIM 309400)。ATP7A基因近半數突變位于外顯子4、9、10和15。BAKKAR等[10]研究發現，ATP7A基因中攜帶p.Met1311Val(M1311V)替代變種，該突變對其作為Ctr1的作用產生負面影響，并損害運動神經元功能和形態。門克斯病是一種由ATP7A基因突變引起的X-連鎖隱性遺傳病，基因突變導致ATP7A功能障礙，進而引起體內銅分布異常，神經組織、肝臟和血液中的銅含量嚴重缺乏。門克斯病患者的臨床特征可以解釋為缺乏銅依賴酶[8]。該病發病率為0.000 27%～0.000 33%[11]，到目前為止，已發現超過270種ATP7A基因突變可以導致該疾病的發生。FUJISAWA等[12]通過聚合酶鏈式反應擴增和外顯子的直接測序明確診斷門克斯病，該研究調查了日本1975—2013年間的66例患者，共檢測到55種不同的突變，其中20種是新突變，突變位于6個銅結合位點、第1～3和第6跨膜區以及ATP結合位點周圍。毛雨鴿等[13]研究發現，銅補充劑作為門克斯病的一線治療藥物，可直接提高腦內和血清中的銅含量。側腦室注射高劑量攜帶有ATP7A基因的重組腺相關病毒9型(rAAV9-sATP7A)聯合肌內注射銅-組氨酸有望成為新的治療方式，但其安全性和有效性仍有待臨床試驗證實[13]。

1.3 DMT1DMT1基因定位于12號染色體，含有43 999對堿基，包含17個外顯子，cDNA全長4 142 bp，最初被稱為自然抗性相關巨噬細胞蛋白2(natural resistance associated macrophage protein 2，Nramp2)，后因研究證明其可轉運Fe2+和Cu2+等離子，故又被命名為二價金屬離子轉運體[14]。DMT1蛋白結構包括12個跨膜結構域、膜內的氨基和羧基末端，第4跨膜區是其重要功能區域，若發生突變會嚴重影響DMT1的正常功能，其mRNA由不同的剪切方式產生+IRE和-IRE兩種類型。

DTM1作為維持胞內二價金屬離子穩態的重要轉運蛋白，其基因廣泛表達于小腸、肝臟、腎臟和肺等組織器官[15]，主要分布在細胞內循環的內吞小泡和細胞膜上，可以轉運鐵、銅、錳等多種二價金屬離子，發生異常所關聯的疾病是小細胞低色素性貧血并肝鐵過載。

2 肝臟銅代謝相關蛋白

2.1 ATP7BATP7B基因定位于染色體13q14.3，全長約85 kb，包括21個外顯子和20個內含子，由1 465個氨基酸組成[16-17]。主要在肝臟和腎臟中表達，肺、胎盤和大腦中也有少量表達。ATP7B是一種跨膜蛋白，主要由3個部分構成：(1)6個N-端銅離子結合區，每個大約包含30個氨基酸，每個ATP7B分子可與6個Cu2+結合；(2)8個不連續的橫跨膜離子通道，是金屬離子轉運區域的標記；(3)P型 ATP功能區，P-domain是P型ATP酶的標記、A-domain使ATP酶結構還原、N-domain是ATP的結合點。其中外顯子2可與細胞質中游離的Cu2+結合，即位于N-端的MBDs。

ATP7B主要的生物學功能是在肝細胞中將胞質內ATOX1蛋白攜帶的Cu2+轉運至TGN，并將銅負載到新合成的CP上，參與CP的合成。在高銅濃度下，ATP7B轉運至溶酶體，將過量的銅運輸至囊泡，通過胞吐作用隨膽汁經膽小管排泄[15]。在此過程中，ATP水解，為ATP7B磷酸化提供能量，隨后再進行脫磷酸化，為銅跨膜供能[17]。就ATP7B而言，不同突變間的致病性存在較大差異。即使是位于同一結構域的臨近突變，也可能存在截然不同的功能特性。ATP7B主要基因突變、功能改變及臨床表型見表1。

表1 ATP7B突變、功能改變及臨床表型Tab.1 ATP7B mutation，functional changes and clinical phenotype

ATP7B發生突變后可引起肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration，HLD)，又稱Wilson病(wilson’s disease，WD)，是一種常染色體隱性遺傳病。ATP7B突變后無法與Cu2+結合，導致銅在肝臟、大腦等組織器官中形成系統性沉積，繼而引起各種臨床表現。主要表現為進行性加重的肝硬化、錐體外系癥狀、精神癥狀、腎損害及角膜色素環(kayser-fleischer ring，K-F環)等，以進行性肝病和神經精神障礙最常見。WD患者因ATP7B功能異常，導致高爾基體中CP無法承載銅，因此無法適當地將銅排泄到膽汁中[18]。《中國肝豆狀核變性診治指南2021》[19]簡化了HLD的診斷標準，指出臨床上對于高度懷疑患者篩查ATP7B基因是否發生p.R778L、p.P992L和p.T935M 3種突變類型的重要性，強調ATP7B基因篩查對于“可能肝豆狀核變性”患者的重要性。目前，WD的治療核心主要是抑制銅的吸收和促進銅的排泄。指南強調出現癥狀前的個體以及經過治療癥狀穩定的患者的維持治療，可單用鋅劑或者聯合應用小劑量絡合劑。指南同時指出，肝移植術后患者應堅持低銅飲食并口服鋅劑，并對D-青霉胺、二巰丙磺酸鈉、二巰丁二酸膠囊及鋅制劑的用量作出了新的規范要求。ZHOU等[20]通過隨機對照試驗比較WD患者在用金屬質子治療期間大腦磁敏感加權成像變化的方法，認為與D-青霉胺相比，使用二巰丙磺酸鈉和二巰丁二酸的治療可更快改善WD患者的神經癥狀，減少惡化概率，為臨床用藥提供指導。CAI等[21]通過對WD患者的糞便樣本進行16S rRNA測序，并與健康人群進行比較，發現WD患者腸道微生物群的多樣性和組成明顯低于健康個體以及前組宿主免疫和代謝相關系統通路所涉及的菌群數量較低的現象，這為未來從腸道微生物菌群著手治療WD提供了新的思路。湯珊等[22]研究發現，CRISPR/Cas9介導的ATP7B點突變校正是可行的，有可能應用于臨床治療WD。VTX-801是一種攜帶小型功能性ATP7B銅轉運體基因的腺相關病毒藥物，其治療機制在于通過外源性導入銅轉運體基因來恢復肝細胞的銅代謝水平。2021年8月，Vivet Therapeutics公司和輝瑞公司共同宣布VTX-801獲得美國食品藥品監督管理局快速通道資格。目前VTX-801基因療法已在臨床前模型中得到了驗證，并已獲得美國食品藥品監督管理局和歐盟委員會的孤兒藥資格認定[22]，這是WD基因治療藥物的一項重大進展。

2.2 COMMD1 人類COMMD1基因定位于染色體2p13-16，全長約235 kb，包括3個外顯子和2個內含子。COMMD1蛋白質包含190個氨基酸，具有代表性的COMMD結構域位于殘基C-端，N-端含有多個α-螺旋結構。該蛋白在多種組織中均有表達，肝臟中與ATP7B的N-端直接相連。

COMMD1是COMMD蛋白家族中最典型的成員，是一種多功能性因子，參與許多生理過程的調節，包括銅穩態、離子轉運、氧化應激、蛋白質運輸、NF-κB介導的轉錄、缺氧誘導的轉錄、DNA損傷反應和腫瘤發生等。COMMD1調節ATP7A和ATP7B的穩定性，誘導突變或錯誤折疊的轉運體泛素化和蛋白酶體降解，突變導致門克斯病和WD，其第164位天冬氨酸的同義突變p.D164D(c.492T>C)是ATP7BH1069Q純合突變患者神經和肝臟癥狀早發的重要因素。COMMD1基因變異已被證明會導致伯靈頓犬發生銅中毒，其臨床表現與人類WD相似[5]。

3 血液轉運銅相關蛋白

3.1 CP CP又稱銅氧化酶，是一種含銅的α2糖蛋白。人體CP基因定位于8號染色體3q24-q25.1，基因長度為45～65 kb，包含19個外顯子，由1 046個氨基酸和附著的4個寡糖-氨基葡萄糖組成，其相對分子質量約為132 kD。CP以單一多肽鏈的形式存在于人體中，完整的單一多肽鏈自動裂解后形成3組由結構域A1、A2、B組成的異體同形單元。每單元約有350個氨基酸殘基，3組單元間氨基酸序列高度同源。血漿中CP可結合6個銅原子，一、六區的交界面上的3個銅原子形成三核銅簇，對CP的催化活性和結構穩定有著重要作用，其余3個銅原子以單核形式存在于二、四、六區。CP屬于多銅氧化酶家族，具有氧化酶功能，可將Cu+氧化為Cu2+，使其在體內進行轉運與代謝。XU等[23]研究發現，當CP水平<20 mg/dL時，WD的敏感性為99%、特異性為80.9%，CP水平<15 mg/dL時，WD的敏感性為95%、特異性為95%。此外CP與WD、遺傳性銅藍蛋白缺乏癥(hereditary aceruloplasminemia，HA)以及阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)等密切相關。

HA是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，CP是其致病基因，主要臨床表現為血色病、胰島素依賴型糖尿病、視網膜變性、錐體外系癥狀、皮質下癡呆等神經系統退行性變性癥狀，多數有輕度貧血[24]。Cu2+結合結構域發生突變，會導致銅結合能力下降；糖基化修飾區的氨基酸發生突變，會導致CP滯留內質網；框移突變及無義突變，會導致CP表達量下降；氧化酶活性區域的氨基酸發生點突變，會導致CP亞鐵氧化酶活性下降[5,24]。CP發生錯義突變，會致使其與銅的結合能力缺失，如Q692K、D58H、G969S和G631R等突變。AD是一種常見的中樞神經系統退行性疾病。鄧青芳等[25]的研究發現，AD與CP異常相關，血液中游離銅水平與AD患者的認知能力成負相關，并可預測認知能力喪失的速度。AD患者腦脊液中有活性的CP減少，非活性的銅增加，這一病理變化可能對AD的發生發展起一定作用。

3.2 乙酰輔酶A轉運體 乙酰輔酶A轉運體主要功能是CP乙酰化修飾，其致病基因為SLC33A1。發生異常時會出現低銅、CP缺乏及銅缺乏等癥狀，與之相關聯的疾病是Huppke-Brendl綜合征[5]。該綜合征是一種致死性的常染色體隱性遺傳病，伴有嚴重的發育遲緩、聽力喪失以及先天白內障，患者的腦MRI表現為明顯的小腦發育不全和髓鞘形成不良，與門克斯病相似。

4 組織細胞利用銅相關蛋白

4.1 AP-1 AP-1定位于染色體7q22.1上的AP1S1基因，相對分子質量為100 kD，編碼受體分子上起連接信號蛋白作用的小S亞單位(σ1A亞基)[26]。AP-1定位于TGN和內體，與網狀蛋白結合參與ATP7A、ATP7B從TGN和內體向質膜運輸及網狀蛋白外殼的組裝[27]。

MEDNIK綜合征是由AP1S1基因的7q22.1位點發生隱性突變引起的一種罕見的常染色體隱性神經皮膚遺傳疾病，此時AP-1介導的細胞內轉銅蛋白異常轉運，ATP7A和ATP7B有完整的酶活性，但功能發生障礙，導致銅代謝功能障礙、銅運輸不足以及銅依賴酶減少[26]。AP1S1調節ATP7A在細胞內正確定位的發現，首次證明MEDNIK綜合征是一種銅代謝紊亂相關疾病。結合門克斯病和WD在銅代謝異常方面的表型特征，MEDNIK綜合征的臨床表現為角化病、魚鱗病、腸病、聽力喪失、智力低下和周圍神經病，新生兒從出生到1歲間即可表現出相關臨床癥狀[26]。MEDNIK綜合征可以將表現出復雜的神經皮膚表型、腸道疾病的臨床評估和家族史調查作為診斷輔助，建議在魚鱗病和智力殘疾兒童的鑒別診斷中考慮進行AP1S1基因分析。

4.2 ATOX1 人體ATOX1基因(human ATX1 homologue，HAH1)定位于染色體5q32-5q33，全長502 bp。編碼的ATOX1是含68個氨基酸的多肽，經加工形成具有穩定結構的單鏈蛋白質，含2個α螺旋、2個β折疊和1個N-端MXCXXC的結構域，其N-末端的兩個半胱氨酸殘基負責結合Cu+。

HAH1與ATOX1有著相似的抗氧化活性，均可將Cu+轉運給具有抗氧化作用的相關蛋白，但自身卻無抗氧化功能。位于hCtr1 C-端8肽的Cu+被轉移給ATOX1[28]，ATOX1與之結合后，通過利用ATP水解釋放出的能量將銅轉運至TGN上ATP7A和ATP7B的-NH2末端，參與合成各種銅依賴酶。

ATOX1通過變構調節MBDs啟動ATP7A/B泵的活性[8]。在體外實驗中，純化的ATOX1銅結合能力隨著時間的推移而減弱[29]。GE等[30]發現，ATOX1與CCS的結構域Ⅰ在體外的磁共振波譜相互作用下促進銅的交換。ATOX1代謝紊亂時，會引起系統性銅缺乏，嚴重時會導致胚胎死亡或哺乳期夭折[1]。

4.3 CCSCCS基因定位于染色體11q13.2，由274個氨基酸殘基組成[30]。CCS蛋白含有249個氨基酸，相對分子質量約29 kD。CCS單體有3個不同作用的結構域：(1)結構域Ⅰ位于N-端，由88個氨基酸組成，N-端含一個MXCXXC金屬結構域(銅結合位點)，類似于ATOX1；(2)結構域Ⅱ位于中間，與SOD1高度同源但無SOD活性；(3)結構域Ⅲ位于C-端，是由40個氨基酸殘基組成的一段無規則卷曲的多肽鏈，C-末端含有分子內S-S橋形成所需的銅催化CXC位點[8,31]。

CCS是存在于細胞質中SOD1的銅伴侶分子，能將Cu+專一性地插入SOD1的銅結合位點，促進形成二硫鍵介導激活SOD1，Cu2+位于SOD1的活性中心，通過得失電子實現SOD1的歧化作用[32]。SOD1活性在蛋白水平上受銅調控，而SOD3活性在基因水平上受銅調控[8]。細胞正常增殖發育必須依賴SOD1的抗氧化作用，因此通過抑制CCS的表達實現抑制腫瘤細胞的增殖。CCS的缺乏會導致SOD1發生缺陷、活性下降，甚至是CCS缺乏癥[5]。HATORI等[29]指出，銅缺乏時CCS上調與ATOX1交換、分配銅，供SOD1成熟。

4.4 COX17COX17功能基因定位于3號染色體，假基因定位于17號染色體。COX17編碼的酸性蛋白定位在胞質與線粒體內膜之間，含有69個氨基酸殘基，相對分子質量為8.2 kD。COX17的C-端含有線粒體結合位點，可將由Ctr1轉運至胞內的Cu+轉運至線粒體，通過線粒體膜上的SCO1/2將Cu+組裝到位于呼吸鏈末端傳遞電子的COX中。COX17以未折疊的形式進入線粒體膜間隙，從線粒體腔接受銅，并向COX11輸送銅。Cu2+是COX的活性中心，通過參與呼吸鏈電子的傳遞產生能量[26]。COX17代謝紊亂會使COX活性下降[5]，缺失可導致呼吸鏈缺陷，嚴重可導致胚胎死亡[1]。

5 總結與展望

銅作為機體必須的微量元素，在人體正常生命活動中發揮著重要作用，但同時具有一定毒性，超載或缺乏都會引起相關疾病。研究生理狀態下銅代謝的相關基因、蛋白表達、生理功能，有助于了解臨床上與之關聯的疾病，為臨床治療提供方向。目前與銅代謝相關蛋白相關的問題主要集中于以下兩點：一是可能存在尚未被發現的銅代謝相關蛋白；二是關于已發現的相關蛋白的研究仍有新突破可能，如CP在AD發生發展過程中的作用機制，胚胎期Ctr1發生異常所導致的疾病等。銅代謝的研究與發展前景十分廣闊，一方面利用一些新技術、新手段，如Duolink?PLA?技術、lcp結晶和微晶電子衍射(Microed)可能會發現新的基因突變位點，為臨床治療提供新的靶點。另一方面針對已發現的銅代謝相關蛋白的研究，主要分兩個層次，一是因基因突變引起的銅代謝疾病可采取基因治療，但受限于倫理；二是非基因突變引起的銅代謝疾病存在突破可能。今后可進一步研究兩者關系，將銅代謝的基礎研究與關聯疾病的臨床實踐相結合，探討致病機制，采取針對性治療手段，以提高臨床療效。