藏藥馬錢子炮制工藝的優化及質量標準研究

馬應風,多杰才讓*,于永青,慕曉旭,魯 雪

1.青海省藏醫院,西寧 810007;2.藏藥研發國家重點實驗室,西寧 810016;3.西寧市第二人民醫院,西寧 810003

馬錢子為馬錢科植物馬錢（Strychnosnux-vomicaL.）的干燥成熟種子。冬季采收馬錢的成熟果實,取出種子,曬干即為馬錢子[1]。馬錢子又稱番木鱉[2],藏語名為“果西拉”[3]。中醫臨床的入藥方法為冬季果實成熟后采摘,除去果肉,取出種子,曬干后炮制入藥[4]。馬錢子雖為藏藥常用藥材,但由于其具有毒性,故使其臨床應用受到了一定限制[5]。藏藥材的炮制與臨床安全用藥緊密相關,對馬錢子進行炮制的主要目的是提高療效、降低毒性。因此,明確其毒性成分或有效成分是確定炮制工藝的關鍵。

在藏藥制劑生產中,馬錢子需經炮制才能入藥。據統計,在青海省藏醫院300多種成方制劑中,含馬錢子的制劑約占5%。馬錢子具有止痛、解毒的效果,用于治療血龍上亢、胃腸絞痛、中毒癥[6]。臨床上常用于氣血上壅癥（高血壓、高血脂）的治療。《中華藏本草》中記載馬錢子具有消腫、止痛、清心熱、干黃水的功效,用于治療咽喉痹痛、風濕性關節炎、蟲牙、痞塊、癰疽、腫痛、血龍病、血熱病[7]。《中國藏藥材大全》中記載馬錢子能夠殺蟲、去腐、干黃水、愈瘡,用于治療胃疫癘、培根瘀紫癥、中毒癥[8]。其在藏醫藥領域中的應用歷史悠久、用途廣泛。

關于馬錢子的炮制方法,《藏藥炮制技藝大全》等中記載:將馬錢子放入炭火或草木灰中燙去外皮,取出,每7粒馬錢子加2捧犏牛奶煮沸,煎熬至剩余五分之三后取出,棄去奶渣,用清水洗凈,晾干備用。因馬錢子有毒,故用于炮制馬錢子的犏牛奶需掩埋[9-11]。現代研究表明,馬錢子的主要有效成分為2種生物堿,其中最重要的為番木鱉堿（士的寧）和馬錢子堿,這2種生物堿既是主要生物活性成分,又是主要毒性成分,基于傳統的藏醫藥理論,采用科學、合理的炮制手段去毒,對于控制藥材的不良反應,保證制劑的用藥安全尤為重要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030型高效液相色譜儀[四元泵、UV檢測器,島津企業管理（中國）有限公司];威立雅超純水機（威立雅水處理技術上海有限公司）;XS-204（萬分之一）、XS-205（十萬分之一）電子天平,均購自梅特勒托利多儀器有限公司。

1.2 試藥

生馬錢子購自安徽亳州藥材市場,經國醫大師尼瑪鑒定為馬錢科馬錢子屬植物馬錢（StrychnosnuxvomicaL.）的成熟干燥種子;馬錢子總生物堿對照品（批號112030-201601,馬錢子堿質量分數為45.40%,士的寧質量分數為49.9%,中國食品藥品檢定研究院）;乙腈（色譜純,山東禹王和天下新材料有限公司）;水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 馬錢子炮制方法

2.1.1 傳統馬錢子炮制方法 取馬錢子生品200 g,用水浸泡1 d,剝皮備用。先將犏牛奶90 g煮開后,再倒入樣品30 g左右（馬錢子與犏牛奶的比例約為1∶3）,武火煮沸,計時,文火微沸,至相應的時間（見表1）,取出,清洗數次,至無奶渣為止,曬干,備用。

2.1.2 優化馬錢子炮制方法 取馬錢子生品350 g,粗粉碎,去皮,過1 號篩備用。先加犏牛奶90 g 或180 g,煮開后,倒入樣品約30 g（馬錢子與犏牛奶的比例為1∶3或1∶6）,武火煮沸,計時,文火微沸,至相應的時間（見表1）,取出,清洗數次,至無奶渣為止,曬干,備用。

表1 傳統馬錢子炮制方法和優化馬錢子炮制方法的樣品信息Tab.1 Sample information of traditional Nux vomica L.processing method and optimized Nux vomica L.processing method

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定馬錢子總生物堿對照品13.01 mg,分別置于10 mL 量瓶 中,加 三氯甲烷適量使其溶解并稀釋至刻度,搖勻。分別精密量取該溶液2 mL,置于同一個10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得（每1 mL含士的寧0.129 82 mg、馬錢子堿0.118 12 mg）。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別將2.1項下各時間段炮制品粉碎,過3號篩,精密稱取粉末0.6 g,置于具塞錐形瓶中,加氫氧化鈉溶液（取氫氧化鈉4.3 g,加水定容至100 mL,即得）3 mL,混勻,放置30 min;精密加入三氯甲烷20 mL,密塞,稱定質量,置于水浴中回流提取2 h,放冷,再稱定質量;用三氯甲烷補足減失的質量,搖勻,分取三氯甲烷液,用鋪有少量無水硫酸鈉的濾紙過濾,棄去初濾液,精密量取續濾液3 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,經0.45μm微孔濾膜過濾,取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀的等量混合溶液（用體積分數為10%的磷酸調節pH 值至2.8）（21∶79）為流動相;檢測波長為260 nm。理論板數按士的寧峰計算應不低于5 000。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定,即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性實驗 按照2.2.3項下色譜條件,分別精密吸取供試品、對照品溶液各10μL,分別注入高效液相色譜儀。記錄色譜圖,結果見圖1。由圖1可見,在與對照品色譜圖相應的保留時間上,有相同的色譜峰。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 標準曲線的繪制 精密吸取混合對照品儲備液（每1 mL含馬錢子堿0.504 8 mg、士的寧0.554 8 mg）,按照2.2.1項下對照品溶液的制備方法制成一系列不同質量濃度的混合對照品溶液,按照2.2.3項下色譜條件測定,以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）,繪制標準曲線,求得回歸方程:y1=2×106x1+874.75,r=0.999 9;y2=2×106x2-228 8.2,r=0.999 9。結果表明,馬錢子堿、士的寧質量濃度分別在0.031 5～0.504 8、0.034 6～0.554 8 mg·mL-1的范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度實驗 按照2.2.3項下色譜條件,精密吸取馬錢子總生物堿對照品溶液10μL,連續進樣6次,測得馬錢子堿、士的寧的RSD 值分別為1.05%、1.26%,表明儀器的精密度良好。

2.3.4 穩定性實驗 取同一供試品溶液（18號）,分別在0、2、4、8、10、12、24 h測定,按照2.2.3項下色譜條件測得馬錢子堿、士的寧的峰面積,計算得馬錢子堿、士的寧的RSD 值分別為0.75%、1.25%,表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

2.3.5 重復性實驗 取同一批供試品（18號）,按照2.2.2項下方法制備6份供試品溶液,分別進樣,按照2.2.3項下色譜條件測得馬錢子堿、士的寧的平均含量分別為8.687 4 mg·g-1、RSD=1.45%;1.542 2 mg·g-1、RSD=1.06%,表明方法的重復性良好。

2.3.6 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的供試品粉末6份,每份約0.3 g,加入對照品溶液（馬錢子堿的質量濃度為0.533 3 mg·mL-1,士的寧的質量濃度為0.586 2 mg·mL-1）2、5、10 mL 按照2.2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.2.3項下色譜條件測定,計算得馬錢子堿的平均回收率為99.7%,RSD值為1.75%;士的寧的平均回收率為102.2%,RSD值為0.22%。結果見表2。

表2 回收率實驗結果Tab.2 Recovery experimental results

2.3.7 傳統馬錢子炮制方法和優化馬錢子炮制方法的樣品對比含量測定 分別取馬錢子各時間段炮制品,按照2.2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.2.3項下色譜條件測定,分別吸取供試品溶液各10μL,分別注入液相色譜儀,記錄峰面積,計算炮制品中馬錢子堿和士的寧的含量。結果見表3。

表3 樣品對比含量測定結果Tab.3 Comparison of sample content determination results

2.3.8 樣品含量測定 分別取按照2.1.2項下優化馬錢子炮制方法奶煮10 min的樣品10份,按照2.2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.2.3項下色譜條件測定,分別吸取供試品溶液各10μL,分別注入液相色譜儀,記錄峰面積,計算炮制品中馬錢子堿和士的寧的含量。結果見表4。

表4 樣品含量測定結果Tab.4 Sample content determination results

3 討論

馬錢子屬于劇毒類藥材,中醫炮制的目的主要是減毒,以擴大其治療窗。盧軍等[12]研究發現,應用砂燙法對馬錢子進行炮制后,毒性成分的含量均降低,同時有效成分的含量有所升高。史磊等[13]研究發現,應用油炸法對馬錢子進行炮制,溫度在215～235℃時,毒性成分的含量相對降低,同時有效成分的含量有所升高。應用現代炮制方法烘焙法對馬錢子進行炮制后,毒性較大的成分含量顯著降低,而其他成分的含量相對穩定[14]。應用爆壓法對馬錢子進行炮制,其毒性物質的含量顯著降低,毒性與生品馬錢子相比明顯降低[15-16]。潘揚等[17]研究發現,應用發酵法對馬錢子進行炮制,其發酵品的半數致死量（LD50）明顯升高,其毒性顯著降低。傳統炮制方法使馬錢子毒性降低是由于士的寧和馬錢子堿在加熱過程中醚鍵斷裂開環,轉變成其異型結構和氮氧化合物,被轉化的這些生物堿毒性變小,且保留或增強了某些生物活性,從而降低了馬錢子的毒性[18-19]。而藏醫傳統的剝皮奶煮法和改良的粗粉碎去皮奶煮法與維吾爾醫的牛奶浸漬[20-21]炮制方法原理相似,可顯著降低生馬錢子中士的寧的含量,可能是牛奶中的蛋白質與生物堿結合形成某種新物質并溶解于牛奶中,使得炮制品中生物堿的含量大幅下降,而這種結合必須是在一定的溫度下發生,這種推斷還有待深入研究[22]。

馬錢子藏藥炮制工藝至今仍然停留在依靠炮制人員經驗控制的水平,很難控制炮制質量,批次間有效成分含量的差異大,不利于制馬錢子飲片的規范化、標準化[23]。目前制定和頒布的馬錢子炮制品質量標準[3]中,炮制工藝缺乏定性、定量的數據,各生產單位因炮制工藝和水平參差不齊,炮制過程難以把握（如方法不同,時間不一,火候不均等）,影響其炮制質量和制劑療效,有必要對其炮制工藝進行系統地量化研究,確定客觀、科學的炮制工藝參數,制定合理的炮制工藝規范,以利于炮制品質量標準的制定,從而保證炮制品質量的可控性。藏藥炮制要與時俱進,在繼承傳統炮制精髓的基礎上,應用現代科學理論與技術,研究炮制前、后藥材的理化性質和藥理作用的變化,揭示炮制提高藥物療效、降低藥物不良反應的原理,以適應藏醫藥的發展。

本研究表明,傳統藏醫去皮奶煮法,去皮耗時長,耗費人力多,煮沸時間較長,調研時,煮沸時間最短為0.5 h,最長為5 h,各地藏醫院炮制的時間長短不一。采購去皮馬錢子,經本次對藥材的鑒別預實驗表明,去皮馬錢子灰分超標,其水溶液呈堿性,存在用堿性物質去皮的現象,存在安全隱患。采用粗粉碎去皮的方法,能夠降低人工剝皮的成本,并縮短炮制周期,采用藥材與犏牛奶比例為1∶3,使藥材充分浸泡于犏牛奶中,采用先加熱牛奶后加藥材的步驟,使藥材與牛奶接觸的時間可控,煮沸時間延長,有毒物質的含量下降。本研究結果能為藏醫炮制馬錢子確定最佳炮制工藝提供參考依據。