玉屏風散治療慢性阻塞性肺疾病大鼠的作用及機制

雷 雪,陳 碧,朱述陽

徐州醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,徐州 221000

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）是常見的呼吸系統慢性疾病,以不完全可逆的氣流受限、氣道炎癥反應持續激活為特征,目前尚缺乏逆轉氣流受限、抑制氣道炎癥的特效治療手段[1-2]。中醫理論認為COPD 屬于“肺脹”“喘證”的范疇,病機復雜,如肺氣虧虛、痰瘀阻滯等均與COPD 的發病有關[3-4]。玉屏風散是具有益氣固表、補虛理肺功效的中藥材,有研究報道應用玉屏風散治療由PM2.5所致肺損傷大鼠能夠改善其氣道功能、抑制炎癥反應[5];變應性鼻炎相關的研究則證實玉屏風散抑制炎癥反應的作用與其下調核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的表達水平有關[6-7]。本研究將玉屏風散用于COPD 大鼠的治療,旨在闡明玉屏風散治療COPD 的作用及機制,進而為臨床治療COPD提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

顯微鏡（日本尼康公司）;動物肺功能儀（意大利科時邁公司）;凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

玉屏風散水煎劑[中國科學院大學深圳醫院（光明）中藥房];陰性對照（NC）慢病毒及NF-κB慢病毒（上海吉瑪制藥技術有限公司）;HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）的酶聯免疫吸附法試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司;NF-κB 及β-actin一抗均購自英國Abcam 公司。

1.3 動物

成年雄性SD 大鼠,許可證號SYXK（浙）2019-0003,購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及干預

為研究玉屏風散治療COPD 的價值,將成年雄性SD 大鼠隨機分為對照組、COPD 組、玉屏風散組。對COPD 組、玉屏風散組進行COPD 造模。方法:第1、14天時分別麻醉大鼠,在胸骨上方1 cm 處切開氣管并注入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）200μg;第2～13天、第15～28天時將大鼠放入吸煙箱內,每次燃燒10支香煙,持續約30 min,每日2次,2次間隔4～6 h。玉屏風散組從第29天起進行干預,給予玉屏風散1.98 g·kg-1灌胃,每日1次,連續處理14 d。

為研究NF-κB 在玉屏風散治療COPD 中的作用,將成年雄性SD 大鼠隨機分為NC 慢病毒組、NC慢病毒+COPD 組、NC慢病毒+玉屏風散組、NF-κB慢病毒+玉屏風散組。NC 慢病毒+COPD 組、NC慢病毒+玉屏風散組、NF-κB 慢病毒+玉屏風散組于第1～28天時進行COPD 造模;第29天時經尾靜脈注射4.0×107TU·mL-1慢病毒載體50μL,給予玉屏風散1.98 g·kg-1灌胃,1次/d,連續處理14 d。

2.2 肺功能檢測

末次給藥后24 h進行肺功能檢測,麻醉后進行氣管插管,連接肺功能儀和呼吸機,設置潮氣量為10 mL·kg-1、呼吸頻率為60次·min-1,記錄自主呼吸狀態下的肺活量（forced vital capacity,FVC）、0.1 s呼氣量（forced expiratory volume 0.1,FEV0.1）、呼氣峰值流速（peak expiratory flow,PEF）。

2.3 肺組織病理改變檢測

完成肺功能檢測后處死大鼠,收集適量肺組織,以質量濃度為40 mg·L-1的多聚甲醛固定后制做4μm 厚度的病理切片,用HE染色試劑盒進行染色,染色后在顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。

2.4 肺組織中TNF-α、IL-6含量的檢測

收集適量肺組織,加入組織裂解液后勻漿,離心收集上清,采用BCA 法試劑盒檢測蛋白濃度,采用酶聯免疫吸附法試劑盒檢測TNF-α、IL-6的含量,計算每毫克蛋白中TNF-α、IL-6的含量。

2.5 肺組織中NF-κB表達水平的檢測

收集適量肺組織,加入組織裂解液后勻漿,離心收集上清并加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gel,SDSPAG）,電泳分離不同相對分子質量的蛋白后電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜,以質量濃度為50 mg·L-1的脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h,用1∶1 000稀釋的NF-κB一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜過夜,次日用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育PVDF膜1 h,最后在凝膠成像儀中顯影得到NF-κB和β-actin,以β-actin的吸光度值為內參,計算NF-κB的相對表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件錄入數據并進行統計學分析,實驗數據屬于計量資料,多組間比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 玉屏風散對COPD 大鼠肺功能的調節作用

與對照組比較,COPD 組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均顯著降低（P＜0.05）;與COPD 組比較,玉屏風散組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF 均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 3組大鼠FVC、FEV0.1和PEF的比較 （,n=8）Tab.1 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 3 groups（,n=8）

表1 3組大鼠FVC、FEV0.1和PEF的比較 （,n=8）Tab.1 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 3 groups（,n=8）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與COPD 組比較,#P＜0.05。

3.2 玉屏風散對COPD 大鼠肺組織病理改變的調節作用

對照組大鼠肺組織內結構正常;COPD 大鼠肺組織內肺泡出現破裂,可見炎癥細胞浸潤;玉屏風散組大鼠肺組織內肺泡破裂、炎癥細胞浸潤較COPD 組改善。結果見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織病理改變的比較（HE染色）Fig.1 Comparison of pathological changes of lung tissue among the 3 groups（HE staining）

3.3 玉屏風散對COPD 大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量及NF-κB表達水平的調節作用

與對照組比較,COPD 組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 的含量及NF-κB 的表達水平均顯著上升（P＜0.05）;與COPD 組比較,玉屏風散組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量及NF-κB 的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2、圖2。

圖2 3組大鼠肺組織中NF-κB表達水平的比較Fig.2 Comparison of NF-κB expression level in lung tissue among the 3 groups

表2 3組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 3 groups （,n=8）

表2 3組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 3 groups （,n=8）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與COPD 組比較,#P＜0.05。

3.4 尾靜脈注射慢病毒過表達NF-κB的效果

與NC慢病毒組比較,NC慢病毒+COPD 組大鼠肺組織中NF-κB的表達水平顯著升高（P＜0.05）;與NC慢病毒+COPD組比較,NC慢病毒+玉屏風散組大鼠肺組織中NF-κB的表達水平顯著降低（P＜0.05）;與NC慢病毒+玉屏風散組比較,NF-κB慢病毒+玉屏風散組大鼠肺組織中NF-κB 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 4組大鼠肺組織中NF-κB表達水平的比較Fig.3 Comparison of NF-κB expression level in lung tissue among the 4 groups

3.5 過表達NF-κB 對玉屏風散調節COPD 大鼠肺功能的影響

與NC慢病毒組比較,NC慢病毒+COPD 組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均顯著降低（P＜0.05）;與NC慢病毒+COPD組比較,NC慢病毒+玉屏風散組大鼠的FVC、FEV0.1和PEF均顯著升高（P＜0.05）;與NC慢病毒+玉屏風散組比較,NF-κB慢病毒+玉屏風散組的FVC、FEV0.1和PEF均顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 4組大鼠FVC、FEV0.1、PEF的比較 （,n=8）Tab.3 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 4 groups（,n=8）

表3 4組大鼠FVC、FEV0.1、PEF的比較 （,n=8）Tab.3 Comparison of FVC,FEV0.1 and PEF among the 4 groups（,n=8）

注:與NC慢病毒組比較,*P＜0.05;與NC 慢病毒+COPD組比較,#P ＜0.05;與NC 慢病毒+玉屏風散組比較,&P＜0.05。

3.6 過表達NF-κB 對玉屏風散調節COPD 大鼠肺組織病理改變的影響

NC慢病毒組大鼠肺組織的結構正常;NC 慢病毒+COPD 組大鼠肺組織內肺泡出現破裂、可見炎癥細胞浸潤;NC慢病毒+玉屏風散組大鼠肺組織內肺泡破裂、炎癥細胞浸潤較NC 慢病毒+COPD 組改善;NC慢病毒+玉屏風散組大鼠肺組織的病理改變較NC慢病毒+玉屏風散組加重。結果見圖4。

圖4 4組大鼠肺組織病理改變的比較 （HE染色）Fig.4 Comparison of pathological changes of lung tissue among the 4 groups（HE staining）

3.7 過表達NF-κB 對玉屏風散調節COPD 大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的影響

與NC慢病毒組比較,NC慢病毒+COPD 組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量顯著上升（P＜0.05）;與NC慢病毒+COPD 組比較,NC慢病毒+玉屏風散組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 的含量顯著降低（P＜0.05）;與NC慢病毒+玉屏風散組比較,NF-κB慢病毒+玉屏風散組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量顯著增加（P＜0.05）。結果見表4。

表4 4組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.4 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 4 groups （,n=8）

表4 4組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6含量的比較 （,n=8）Tab.4 Comparison of TNF-α,IL-6 contents in lung tissue among the 4 groups （,n=8）

注:與NC慢病毒組比較,*P＜0.05;與NC慢病毒+COPD組比較,#P＜0.05;與NC慢病毒+玉屏風散組比較,&P＜0.05。

4 討論

氣流受限、氣道炎癥反應激活是COPD 的主要特征,LPS聯合香煙煙霧吸入是常用的COPD 造模方法[8],本研究采用該方法造模后進行了肺功能及肺組織病理改變檢測,COPD 組大鼠肺組織出現了典型的COPD 病理改變且FVC、FEV0.1、PEF 均顯著降低,與既往文獻[8]中關于COPD 模型大鼠肺功能及肺組織病理改變的描述一致,表明COPD 造模成功。

本研究用COPD 模型大鼠探究治療COPD 的方法。近年,中藥方劑在呼吸系統慢性疾病治療中的價值受到越來越多的重視。玉屏風散由生黃芪、防風、炒白術組成,能夠針對COPD 的中醫病機發揮益氣固表、補虛理肺的作用。有Meta分析表明,玉屏風散用于穩定期COPD 的治療能夠改善肺功能[9];另有臨床研究表明,玉屏風散用于支氣管哮喘的治療能夠起到舒張氣道、緩解哮喘的作用[10]。本研究用玉屏風散治療COPD大鼠后,觀察到其肺組織的病理改變明顯改善且FVC、FEV0.1、PEF均顯著上升,表明玉屏風散能夠顯著改善COPD大鼠的肺功能及肺組織病理改變,提示玉屏風散具有治療COPD的作用。

氣道炎癥反應的持續激活、炎癥細胞因子的大量釋放是與COPD 發病及病情發展密切相關的病理因素。TNF-α和IL-6是已知與COPD 發病密切相關的炎癥細胞因子,有研究報道,COPD 患者血清中及COPD 大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的含量均顯著增加[11-14]。根據現代生物醫學研究的結果,玉屏風散對炎癥反應具有抑制作用,變應性鼻炎相關的動物實驗證實,玉屏風散對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜內TNF-α、IL-6的表達具有抑制作用[6-7];另有細胞實驗證實,黃芪和白術中的活性成分黃芪多肽及白術內酯具有抑制炎癥反應的作用[15-16]。本研究用玉屏風散治療COPD 大鼠后檢測到其肺組織中TNF-α、IL-6的含量明顯降低,表明玉屏風散對COPD 大鼠肺組織的炎癥反應具有抑制作用。

NF-κB是調控炎癥反應的關鍵轉錄因子,直接參與TNF-α、IL-6表達的調控,本研究證實COPD 大鼠肺組織中NF-κB 的表達水平明顯上升,與既往文獻[17-20]中關于COPD 發病過程中NF-κB表達水平升高的結果一致。玉屏風散治療變應性鼻炎的過程中對NF-κB 的表達具有抑制作用,本研究觀察到玉屏風散治療COPD 大鼠能夠使肺組織中NF-κB的表達水平降低,表明玉屏風散可能通過抑制NF-κB 表達的方式改善COPD 大鼠的肺功能并抑制炎癥反應。為了進一步闡明NF-κB在玉屏風散治療COPD 中的作用,本研究通過尾靜脈注射慢病毒的方式過表達NF-κB,在過表達NF-κB后進行玉屏風散干預,結果表明,玉屏風散改善肺功能及肺組織病理改變、抑制炎癥反應的作用減弱,表明玉屏風散治療COPD 的作用與抑制NF-κB的表達有關。

綜上所述,玉屏風散用于COPD 大鼠的治療能夠改善氣道功能、肺組織病理改變并抑制炎癥反應,抑制NF-κB是玉屏風散發揮上述治療作用的分子機制,這為今后發現COPD 新的治療策略提供了實驗依據和思路。