腎康丸對糖尿病腎病大鼠腎功能、胰島素抵抗的影響

黃喬木,何 艷

1.咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院腎內科,咸寧 437000;2.咸寧市第一人民醫院重癥醫學科 咸寧 437000

研究表明,影響腎功能的因素主要有糖尿病、高血壓、家族遺傳等,其中對腎功能影響較大的是糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）[1-2]。早期糖尿病主要影響腎臟入球小動脈及鄰近的血管,隨著病程進展,血流動力學特征逐漸轉化為高阻、低流速和低灌注[3]。足細胞是一種腎小囊臟層上皮細胞,該類細胞是經過高度分化的特異性細胞,可參與維持腎小球濾過屏障功能、調節超濾系數和穩定腎小球毛細血管等[4-5]。腎康丸是一種純中藥制劑,可用于治療慢性腎炎和慢性腎功能衰竭等,可以消除尿蛋白和潛血,同時能穩定降低血肌酐和尿素氮等毒素物質的水平,保護腎功能,延緩慢性腎功能衰竭的進展[6]。本文旨在研究腎康丸對DN 大鼠腎功能、胰島素抵抗和足細胞的影響,以期了解腎康丸保護DN 大鼠的作用機制,從而為DN 的治療提供一定的理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（美國Sigma 公司）;透射電鏡（日本JEOL公司）;ONETOUCHⅡ血糖儀及血糖試紙均購自美國強生公司。

1.2 試藥

腎康丸（批號為20181210,主要由黃芪、金櫻子、蟬蛻、益母草、水蛭和玉米須等制成,咸寧市中心醫院藥劑科;鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）、Trizol柱純化總RNA試劑盒均購自美國Sigma公司;一抗及二抗、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒均購自美國Abcam 公司。

1.3 動物

SPF級雌性SD 大鼠30 只,6～8 周齡,體 質量（200±30）g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號SCXK（京）2017-0022,分6個籠子飼養,每個籠子5只。飼養于醫院動物中心實驗室。

2 方法

2.1 建立DN 大鼠模型

參照文獻[7]構建DN大鼠模型。給予高糖和高脂肪飼料喂養1個月,禁食12 h后腹腔注射25 mg·kg-1STZ。1周后,若STZ注射后連續3d血糖≥16.7 mmol·L-1,尿量＞原尿量150%,尿糖為（+++～++++）,即可判斷糖尿病大鼠模型構建成功。繼續以高糖和高脂肪飼料喂養3個月,當尿蛋白排泄量＞30 mg·d-1,則可認為DN 模型建立成功。

2.2 分組及藥物干預

將30只大鼠分成3組,每組10只。第1組為正常大鼠;第2組為建模組,即DN 模型組;第3組為腎康丸治療組,按大鼠（200 g）與成人（70 kg）的體質量比,計算大鼠的等效劑量。將腎康丸成藥經研磨后用蒸餾水配成質量濃度為350 mg·mL-1的溶液,每日灌液1 mL,模型組灌注等量的生理鹽水。若有死亡的小鼠及時補上。

2.3 檢測項目

2.3.1 大鼠左腎質量、血清肌酐、尿素氮和微量尿蛋白的檢測 處理結束后,稱定大鼠體質量,并收集24 h尿液,檢測微量尿蛋白,腹主動脈取血分離上清檢測血清肌酐和尿素氮含量,處死大鼠后迅速解剖腎臟組織,并稱取左腎質量,計算左腎質量與體質量的比值。

2.3.2 血清胰島素和血糖的測定及胰島素抵抗指數的計算 取大鼠腹主動脈血,使用125I-胰島素放射免疫法檢測胰島素含量,使用ONETOUCHⅡ血糖儀檢測大鼠靜脈血糖。胰島素抵抗指數=（空腹血糖水平×空腹胰島素水平）/22.5。每個實驗重復3次,每組做3次平行實驗,最后將結果取平均值。

2.3.3 大鼠血清總膽固醇和三酰甘油水平的檢測取大鼠血清,按照試劑盒的說明書操作,檢測血清總膽固醇（total cholesterol,TC）和三酰甘油（triglyceride,TG）的含量。

2.3.4 熒光定量PCR 檢測腎組織足細胞裂隙跨膜基因nephrin和肌間線蛋白m RNA 水平 取適量腎組織,用Trizol試劑提取總RNA,逆轉錄合成cDNA模板鏈,再進行熒光定量PCR 擴增,以三磷酸-甘油醛脫氫酶為內參,計算肌間線蛋白（desmin）和nephrin mRNA 的相對表達水平。

2.3.5 蛋白印跡檢測腎組織desmin和nephrin蛋白的表達水平 取適量腎組織,添加蛋白裂解液提取總蛋白,檢測濃度后取50μg蛋白進行凝膠電泳,待蛋白完全分離后,電轉至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜,將PVDF 膜置于脫脂牛奶中,室溫下孵育2 h,封閉非特異性位點,再于4℃下分別孵育desmin、nephrin和β肌動蛋白（β-actin）蛋白一抗過夜,清洗后在室溫下孵育蛋白二抗1 h,最后添加電化學發光法（electro-chemi-luminescence,ECL）發光試劑進行蛋白顯影。以β-actin為內參,計算desmin和nephrin蛋白的相對表達量。

2.3.6 透射電鏡觀察足細胞的超微結構 將腎組織固定于戊二醇溶液中,制成石蠟切片,置于醋酸鈾染液中染色20 min,再置于檸檬酸鋁染液中染色15 min,用透射電鏡觀察足細胞超微結構的變化。

2.4 統計學方法

用SPSS18.0軟件對數據進行處理和分析,數據以均數±標準差表示,多組均數采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 腎康丸對大鼠腎臟質量和腎功能的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠左腎質量/體質量、血肌酐和尿素氮水平有顯著的提高（P＜0.05）;與DN 模型組相比,腎康丸治療組血肌酐和尿素氮水平顯著降低（P＜0.05）,但腎康丸治療組與DN 模型組左腎質量/體質量比較,差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 腎康丸對大鼠腎臟質量和腎功能的影響 （,n=10）Tab.1 Effects of Shenkang Pills on renal weight and function in rats（,n=10）

表1 腎康丸對大鼠腎臟質量和腎功能的影響 （,n=10）Tab.1 Effects of Shenkang Pills on renal weight and function in rats（,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.2 腎康丸對大鼠血糖及胰島素的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠血糖和胰島素抵抗指數顯著升高,胰島素含量顯著降低（P＜0.05）;與DN模型組比較,腎康丸治療組大鼠的血糖和胰島素抵抗指數顯著降低,胰島素含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

表2 腎康丸對大鼠血糖及胰島素的影響 （,n=10）Tab.2 Effects of Shenkang Pills on blood glucose and insulin in rats （,n=10）

表2 腎康丸對大鼠血糖及胰島素的影響 （,n=10）Tab.2 Effects of Shenkang Pills on blood glucose and insulin in rats （,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.3 腎康丸對大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠TG、TC 和微量尿蛋白水平顯著升高（P＜0.05）;與DN 模型組相比,腎康丸治療組大鼠TG、TC和微量尿蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 腎康丸對大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影響（,n=10）Tab.3 Effects of Shenkang Pills on levels of serum TG,TC and microalbuminuria in rats （,n=10）

表3 腎康丸對大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影響（,n=10）Tab.3 Effects of Shenkang Pills on levels of serum TG,TC and microalbuminuria in rats （,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.4 腎康丸對大鼠desmin、nephrin蛋白及m RNA表達水平的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠腎組織desmin蛋白及m RNA 的表達上調,nephrin蛋白及mRNA的表達下調（P＜0.05）;與DN模型組相比,腎康丸治療組desmin蛋白及mRNA 的表達下調,nephrin蛋白及mRNA的表達上調（P＜0.05）。結果見圖1、表4。

圖1 蛋白印跡檢測desmin、nephrin蛋白的表達水平Fig.1 Expressions of desmin and nephrin proteins detected by Western blot

表4 腎康丸對大鼠desmin、nephrin蛋白及mRNA表達的影響 （,n=10）Tab.4 Effects of Shenkang Pills on desmin,protein and m RNA of nephrin in rats（,n=10）

表4 腎康丸對大鼠desmin、nephrin蛋白及mRNA表達的影響 （,n=10）Tab.4 Effects of Shenkang Pills on desmin,protein and m RNA of nephrin in rats（,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.5 腎康丸對大鼠足細胞的影響

腎康丸對大鼠足細胞的影響見圖2。由圖2 可見,正常組大鼠腎小球基底膜清晰,厚度均勻,足突清晰且排列整齊,無融合現象;DN 模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚,厚度不一,足突排列不整齊,且融合現象明顯,足突數量減少;與DN 模型組比較,腎康丸治療組上述腎小球基底膜增厚、足突排列不整齊和融合及數量減少等現象明顯減輕。

圖2 透射電鏡觀察大鼠足細胞Fig.2 Observation of rat podocytes by transmission electron microscope

4 討論

糖尿病患者由于血糖升高,糖基化的終末期產物明顯增多,自由基也明顯增多,使機體發生氧化應激,造成腎臟損傷。同時,這些自由基還可促進免疫反應和炎癥反應,使糖尿病患者血清中的肌酐和尿素氮增多,血壓升高,進一步損傷血管內皮,形成惡性循環,這也是導致糖尿病患者病情不斷加重的原因之一[8-9]。因此,抗氧化對于預防和延緩糖尿病慢性并發癥的發生有重要作用。據報道,用STZ 處理糖尿病大鼠可使其血糖濃度升高,血清中的胰島素含量下降,同時會引起血壓升高、體質量減小、尿蛋白中肌酐和血肌酐含量均上升等癥狀[10]。本實驗中腎康丸處理顯著降低了糖尿病腎病大鼠TG、TC、血肌酐和尿素氮含量,有效緩解了腎臟壓力,起到改善腎功能的作用。

足細胞存在多種細胞體、主突和足突,其功能和結構也不相同,足細胞的足突之間由極薄的裂孔隔膜相連,這種相連的裂孔隔膜和腎小球內皮細胞共同構成腎小球選擇性的分子篩[11]。desmin于1977年被發現,是成熟腎小管上皮細胞的主要標志性結構蛋白之一[12]。研究表明,正常情況下,desmin 在腎小球系膜細胞中的表達量較低,在足細胞中無明顯表達;足細胞受到損傷后,desmin可大量表達,主要原因是足細胞的細胞骨架重新排列[13-14]。因此,desmin可作為評估足細胞是否受損的重要指標。本實驗中,經過腎康丸處理的大鼠desmin蛋白及mRNA 的表達量顯著降低,表明腎康丸可明顯改善DN 大鼠足細胞損傷。nephrin是于腎小球裂孔膜上發現的第一個跨膜蛋白,其表達水平下降會使足細胞及裂孔隔膜的結構和功能發生損傷[15-16]。于梅等[17]報道,對DN 患者進行腎活檢發現nephrin m RNA 的表達水平下降,且其表達水平與蛋白尿程度呈負相關。大量基礎研究發現,足細胞損傷后進行藥物干預后,可通過增高腎組織氧化應激和上調nephrin的表達水平而延緩腎小球足細胞損害,且干預后足細胞數量顯著增多[18-20]。本研究中,經過腎康丸處理的大鼠nephrin蛋白及m RNA 的表達水平顯著上升,說明腎康丸對腎組織中nephrin的表達有一定調節作用,能夠起到減輕足細胞損傷、發揮改善DN 的作用。

綜上所述,腎康丸可緩解DN 大鼠胰島素抵抗,改善腎足細胞超微結構,減輕足細胞的減少與融合,發揮保護腎功能的作用。但因腎康丸是一種中藥制劑,其中的成分并不是單一的,且僅研究藥物劑量相對單一,在后續的實驗中可以提取腎康丸中的不同成分,進一步探討各種成分對腎功能及足細胞的保護機制。