鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的制備與質量評價

熊慧敏,陳安琪,于 華,張 琳*

1.北京聯合大學特殊教育學院,北京 100075;2.泰投華信（北京）科技發展有限公司,北京 100018

鹽酸小檗堿是從中藥黃連中提取的一種季銨生物堿,其對溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌及弗氏和志賀氏痢疾桿菌等均有抗菌作用,已廣泛用于治療痢疾、眼結膜炎以及化膿性中耳炎等細菌性感染性疾病,療效顯著[1]。近年來臨床研究表明,鹽酸小檗堿對幽門螺桿菌引發的慢性胃炎具有一定的治療效果[2]。小檗堿味苦,且普通口服片劑在胃排空作用下快速進入腸道中,在胃內滯留時間較短,影響藥效發揮[3]。胃漂浮系統可延長藥物在胃中的滯留時間,確保在胃中始終維持一定的藥物濃度,增加局部治療效果,減少毒性和不良反應[4]。因此,本研究將鹽酸小檗堿制備成胃漂浮海藻酸鈣微球,以延長藥物在胃中的滯留時間,提高藥物的安全性和有效性,實現胃靶向治療目的[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Chromaster型高效液相色譜儀色譜管理系統（日立科學儀器有限公司）;08-2G 型恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）;SEM3000s型掃描電子顯微鏡（國儀量子合肥技術有限公司）;RCZ-8N 型智能藥物溶出度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）;高精度不銹鋼游標卡尺（日本三豐公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿（東北制藥集團股份有限公司）;蓖麻油和氯化鈣（CaCl2）,均購自湖北葛店人福藥用輔料有限責任公司;殼聚糖（湖南新綠方藥業有限公司）;海藻酸鈉（青島明月海藻集團有限公司）;鹽酸（南京化學試劑股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的制備

經過前期預實驗,本研究采用乳化-交聯固化法制備鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球[7-8]。取處方量的鹽酸小檗堿和海藻酸鈉溶解到100 mL純化水中,在高速（2 500 r·min-1）磁力攪拌下,將處方量橄欖油滴加到海藻酸鈉水溶液中,持續攪拌10 min,形成初乳分散液,再將初乳分散液置于冰水浴中以200 W 功率超聲處理10 min,形成穩定的乳液;另取處方量的CaCl2和殼聚糖加入到質量濃度為50 mg·mL-1的乙酸溶液中,持續攪拌10 min,分散均勻;在低速（500 r·min-1）磁力攪拌下,將上述乳液通過7號注射器針頭滴加到乙酸溶液中,滴加結束后持續放置30 min,充分完成交聯反應;用篩網過濾得到微球,用純化水洗滌,并在40℃烘箱中干燥,得到鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球。

2.2 包封率測定

取一定量鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球置于研缽中研成細粉,精密稱取500 mg粉末,置于50 mL量瓶中,再加入pH1.2鹽酸溶液40 mL,水浴超聲,定容。所得溶液經0.45μm 微孔濾膜過濾,取續濾液測定藥物含量,計算包封率[9]。包封率（%）=實際載藥量（W實）÷理論投藥量（W投）×100%。

2.3 體外漂浮率測定

按照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版溶出度與釋放度測定法中的轉籃法評價鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的體外漂浮性[10]。取50個鹽酸小檗堿海藻酸鈣微球置于轉籃中（pH 1.2的鹽酸溶液、體積為500 mL、溫度為37℃±0.5℃、轉速為100 r·min-1）,12 h后目測漂浮在轉籃頂部的微球數量,按照公式計算鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的漂浮率。漂浮率（%）=漂浮微球數÷微球總數×100%。

2.4 處方優化

2.4.1 橄欖油用量考察 鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球能產生漂浮性是由于處方中加入了橄欖油,其密度約為0.909 g·cm-3。預實驗過程中發現橄欖油在處方中的用量會對鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的漂浮性及藥物包封率產生一定的影響,因此本研究固定處方中海藻酸鈉質量濃度為30 mg·mL-1,CaCl2質量濃度為5 mg·mL-1,殼聚糖質量濃度為5 mg·mL-1,凝膠化30 min,橄欖油用量見表1,按照表1用量依次制備鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球,考察橄欖油用量對藥物包封率和漂浮率的影響。

表1 橄欖油用量對藥物包封率和漂浮率的影響Tab.1 Influence of olive oil amount on encapsulation rate and floating rate

由表1可知,隨著橄欖油用量的增加,鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的藥物包封率呈降低趨勢,這是由于鹽酸小檗堿在水中的溶解度較高,在橄欖油中的溶解度較小,隨著橄欖油用量的增加,微球中包裹的橄欖油增加,因此不利于藥物包封;而鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的漂浮率與橄欖油的用量呈正相關,隨著橄欖油用量的增加,微球中包裹的橄欖油增多,微球更易漂浮。最終確定微球處方中橄欖油用量占比為15%。

2.4.2 實驗設計優化處方 固定橄欖油用量占比為15%,應用Box-Behnken實驗設計考察海藻酸鈉質量濃度（X1）、CaCl2質量濃度（X2）和殼聚糖質量濃度（X3）3個關鍵處方變量對鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球包封率（Y）的影響。實驗設計中3個變量設置為低（+1）、中（0）和高（-1）3個水平,見表2。共進行了17次實驗,實驗結果見表3。

表2 Box-Behnken實驗設計中獨立變量與水平Tab.2 The independent variables and levels in Box-Behnken experiment design

表3 實驗設計及結果Tab.3 Results of Box-Behnken experiment design

使用多元二次方程對實驗數據進行方差分析,結果見表4。由表4可知,回歸方程系數的顯著性,模型P值小于0.05,說明所選模型顯著;一次項（X1,X2,X3）和二次項（）的P值均小于0.05,說明3個處方變量對包封率影響均顯著;失擬項P值大于0.05,說明該模型實測值與預測值之間不存在顯著性差異,能夠準確預測實驗數據[11]。多元二次方程擬合方程為:Y=3.55+2.17X1+4.23X2+4.53X3+0.06X1X2-0.02X1X3+0.20X2X3-0.04（R2=0.998 1）。

表4 海藻酸鈉質量濃度（X1）、CaCl2 質量濃度（X2）和殼聚糖質量濃度（X3）對包封率（Y）影響的方差分析結果Tab.4 The ANOVA results of the influence of sodium alginate concentration（X1）,CaCl2 concentration（X2）and chitosan concentration（X3）on the encapsulation efficiency（Y）

通過效應面圖（見圖1）可更直觀地分析海藻酸鈉質量濃度（X1）、CaCl2質量濃度（X2）和殼聚糖質量濃度（X3）對包封率（Y）的影響。由圖1可知,隨著海藻酸鈉質量濃度、CaCl2質量濃度和殼聚糖質量濃度的增加,鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的包封率均出現先增加后降低的趨勢。海藻酸鈉和CaCl2的質量濃度對包封率的影響可作如下解釋:當海藻酸鈉和CaCl2質量濃度較低時,在凝膠化過程中藥物可擴散出去,藥物包封率較低,而隨著海藻酸鈉和CaCl2質量濃度的增加,體系黏度增大,阻礙了藥物向外擴散,表現為包封率增大,但是隨著海藻酸鈉和CaCl2質量濃度的繼續增加,體系黏度急劇增大,CaCl2很難擴散至海藻酸鈉中發生交聯反應,導致包封率降低[12]。殼聚糖質量濃度對包封率的影響可解釋為:隨著殼聚糖質量濃度的增加,殼聚糖的氨基（NH3+）基團與海藻酸鈉中的羧基（COO-）基團通過靜電作用相互交聯,在微球表面形成聚合物復合膜,從而抑制了藥物向外擴散,藥物包封率增加,但是殼聚糖質量濃度繼續增加,過量的殼聚糖會阻礙CaCl2和與海藻酸鈉交聯,導致包封率降低。

圖1 海藻酸鈉質量濃度（X1）、CaCl2 質量濃度（X2）和殼聚糖質量濃度（X3）對鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球包封率（Y）影響的響應面圖Fig.1 Response surface plot of the influence of sodium alginate concentration （X1）,CaCl2 concentration（X2）and chitosan concentration（X3）on the encapsulation efficiency（Y）of calcium alginate microspheres

本研究要求制備的鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的包封率最大,通過Design-Expert 10.1軟件預測獲得微球的處方設計空間,在設計空間內任選一點（海藻酸鈉質量濃度為33.0 mg·mL-1,CaCl2質量濃度為10.0 mg·mL-1,殼聚糖質量濃度為10.0 mg·mL-1）,經軟件預測得到的鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的包封率為88.6%。按照該處方制備3批鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球,測定包封率為87.4%±1.2%,與預測值之間的誤差為-1.37%,偏差較小,說明模型預測可靠性較高。

2.5 質量評價

2.5.1 粒徑及密度測定 通過游標卡尺測定50個鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的直徑,并精密稱定其質量,計算平均密度。經測定微球的平均直徑為（1.24±0.07）mm,計算得微球的密度為（0.93±0.05）g·cm-3,該值低于水的密度（1.00 g·cm-3）,可確保微球在體內能夠漂浮。

2.5.2 微觀形態觀察 取鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球放在帶有導電膠的鋁板上,真空噴金;另取一粒微球,用鋼刀切成兩半,放在帶有導電膠的鋁板上,真空噴金。取上述2份樣品在掃描電鏡（加速電壓為15 kV）下觀察表面及內部結構,見圖2。

圖2 鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球（A）、微球表面（B）和微球內部（C）的掃描電鏡照片Fig.2 The SEM photographs of the berberine hydrochloride gastric floating calcium alginate microspheres（A）,the surface of the microspheres （B）,and the cross section （C） of the microspheres

鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球照片顯示其為圓整球形,大小均勻,質地堅硬,外觀呈淺褐色半透明狀（見圖2A）;掃描電鏡照片顯示,其外表面較為粗糙（見圖2B）,內部呈多孔狀（見圖2C）,這些結構是在凝膠化過程中產生的,橄欖油被包裹在這些小孔中產生了漂浮力[13]。

2.5.3 體外漂浮性研究 按照2.3項下體外漂浮率測定方法考察鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的體外漂浮性,并觀察微球的外觀。結果顯示,微球在pH1.2鹽酸溶液中會100%立即漂浮,且能持續漂浮12 h,實驗結束時微球均保持其完整性,可推測微球進入體內會長時間漂浮在胃液中。

2.5.4 體外釋放研究 采用《中國藥典》2020年版溶出度與釋放度測定法中的轉籃法評價鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的體外釋放度[14]。取市售小檗堿片和鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球（含有100 mg小檗堿）置于轉籃中,釋放介質為pH1.2鹽酸溶液,體積為500 mL,水浴溫度為37℃±0.5℃,轉速為100 r·min-1,在預定的時間間隔取出5 mL釋放介質（補加同溫同體積空白介質）,經0.22μm 濾膜過濾,稀釋至一定倍數,采用HPLC法檢測藥物含量,繪制藥物累積溶出度-時間曲線。見圖3。同時將釋放數據采用不同釋放動力學方程模型進行擬合,以研究藥物釋放動力學行為。

圖3 市售鹽酸小檗堿片和鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球在pH1.2鹽酸溶液中的釋放曲線 （n=6）Fig.3 The drug release curves of berberine hydrochloride tablets and calcium alginate microspheres in pH1.2 hydrochloric acid solution（n=6）

由圖3可知,小檗堿片在1 h時藥物完全溶出;鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球中藥物顯示出雙相釋藥模式,前2 h藥物釋放量達到36.3%±2.1%,釋放速率較快,這部分是吸附在微球表面的小檗堿被釋放,而從2 h至12 h內微球則表現為持續緩慢釋放藥物,最終藥物釋放量達到88.1%±2.8%,這部分是包裹在微球內部的小檗堿被緩慢擴散。鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球的藥物釋放數據經零級、一級、Higuchi、Korsmeyer-Peppas方程擬合（結果見表5）,結果顯示,鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球中藥物釋放符合Higuchi方程（相關系數R2越接近1說明擬合效果越好）,結果表明,鹽酸小檗堿胃漂浮海藻酸鈣微球中的藥物釋放為擴散機制[15]。

表5 不同釋藥模型擬合結果Tab.5 Fitting results of different release models

3 討論

胃漂浮給藥系統可分為一單元制劑和多單元制劑[16]。一單元制劑的主要代表是漂浮片,由于胃排空速率存在個體間差異,患者在服用漂浮片后藥物在胃內的滯留時間存在不確定性;多單元制劑的主要代表是漂浮微球,它與漂浮片相比具有胃內分布均勻、可避免完全被胃排空、個體間差異小、胃內滯留時間長的優勢。因此本研究將鹽酸小檗堿制備成胃漂浮海藻酸鈣微球。

海藻酸鈣微球主要由海藻酸鈉、CaCl2和殼聚糖構成,海藻酸鈉是從海藻中提取的一種天然多糖高分子化合物,生物相容性良好,可生物降解,由于自身帶有大量的羧基（COO-）基團,可與Ca2+發生凝膠化反應,形成多孔狀海藻酸鈣凝膠[17];殼聚糖是通過天然多糖甲殼素部分脫乙酰基而得到,生物相容性良好,其在酸性環境中帶有大量的氨基（NH3+）基團,可與海藻酸鈉形成聚合物復合膜[18],能夠很好的改善微球表面形態,控制藥物釋放速率,減少藥物突釋。