黃芪甲苷納米膠束的制備及Caco-2單層細胞轉運研究

黃昭峰,徐 麗

1.南京市溧水區人民醫院藥劑科,南京 211200;2.南京市溧水區永陽街道社區衛生服務中心,南京 211200

黃芪甲苷（astragelosideⅣ,AST）是從黃芪中提取的一種皂苷類化合物,具有調節機體免疫力、增強機體抗病能力的功效[1]。AST 在水中溶解性較差,且是P糖蛋白（P-gp）的底物[2],口服生物利用度僅為7.4%[3]。本研究以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic F127）和聚乙二醇1000 維生素E琥珀酸酯（TPGS）作為載體材料[4],通過冷凍干燥-水化法將AST 制備成納米膠束（AST-NMs）,并通過Caco-2 單層細胞轉運實驗評價其體外滲透性,為AST 的口服新劑型研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

K2025高效液相色譜儀（海能未來技術集團股份有限公司）;SY18-1油浴水浴磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）;Pilot10-15S真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）;Zetasizer Ultra納米粒度電位儀（英國馬爾文公司）;JEM-2100透射電子顯微鏡（日本電子公司）;Herocell 240二氧化碳培養箱（上海潤度生物科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芪甲苷（上海源葉生物科技有限公司,質量分數為99.0%,批號S1902214）;聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic F127,南京威爾藥業集團股份有限公司）;聚乙二醇1000 維生素E 琥珀酸酯（TPGS,德國巴斯夫公司）;叔丁醇（濟南金永碩化工有限公司）;蒸餾水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 AST-NMs的制備

通過冷凍干燥-水化法[5]制備AST-NMs。按照處方比例稱取Pluronic F127和TPGS共10 g溶解到100 mL叔丁醇中,再按照比例稱取AST加入到上述溶液中,攪拌直至藥物完全溶解;將液體置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥,收集干燥后的固體塊狀物,研碎,密封保存;稱取固體粉末5 g,置于燒杯中,加入蒸餾水100 mL（水溫為50℃）,在1 000 r·min-1磁力攪拌下水化固體粉末,保持50℃水溫持續攪拌30 min;將溶液冷卻至室溫,加水定容至100 mL,溶液經0.22μm 微孔濾膜過濾,去除不溶性藥物,即得到AST-NMs,4～8℃儲存,備用。

2.2 包封率測定

取AST-NMs溶液1.0 mL,置于50 mL 量瓶中,加入甲醇,超聲破壞膠束,再加入流動相定容,得到待測液。樣品經高效液相色譜-蒸發光檢測器（HPLCELSD）法檢測藥物含量,色譜條件[6]:Hypersil BDS C18色譜柱（150 mm,4.6 mm×5μm）,流速為1.0 mL·min-1,進樣量為20μL,流動相為甲醇-水（75∶25）,柱溫為35℃,蒸發光散射檢測器（ELSD）參數:漂移管溫度為60℃,空氣流速為200 kPa。根據公式計算包封率。所有樣品均測定3次,取平均值。

包封率（%）=W0÷W1×100%,其中,W0表示包載到納米膠束中的藥物量,W1表示投藥量。

2.3 粒徑分布測定

取AST-NMs約200μL 加入到樣品池中,加入適量去離子水稀釋,搖勻,通過納米粒度電位儀測定粒徑分布,設置散射角為173°,波長為633 nm,樣品測定前需在25℃條件下平衡3 min。每份樣品平行測量3次,取平均值。

2.4 實驗設計優化處方

采用中心復合實驗設計考察Pluronic F127 與TPGS質量比（X1）和聚合物與藥物質量比（X2）2個變量對AST-NMs包封率（Y1）和粒徑分布（Y2）的影響,共進行了11次實驗,實驗結果見表1。

表1 實驗設計及結果Tab.1 Results of central composite design

表2 包封率（Y1）方差分析結果Tab.2 The ANOVA of encapsulation efficiency（Y1）

表3 粒徑分布（Y2）方差分析結果Tab.3 The ANOVA of particle size distribution（Y2）

通過響應面圖可進一步直觀分析Pluronic F127與TPGS質量比（X1）和聚合物與藥物質量比（X2）對AST-NMs包封率（Y1）和粒徑分布（Y2）的影響。見圖1和圖2。由圖1可知,隨著X1和X2的增加,包封率（Y1）均出現增加趨勢;由圖2 可知,隨著X1和X2的增加,粒徑分布（Y2）均出現減小趨勢。

圖1 Pluronic F127與TPGS質量比（X1）和聚合物與藥物質量比（X2）對AST-NMs包封率（Y1）的響應面圖Fig.1 Response surface plot of the influence of the ratio of Pluronic F127 to TPGS （X1）and the ratio polymer to drug（X2）on the encapsulation efficiency（Y1）of AST-NMs

圖2 Pluronic F127與TPGS質量比（X1）和聚合物與藥物質量比（X2）對AST-NMs粒徑分布（Y2）的響應面圖Fig.2 Response surface plot of the influence of the ratio of Pluronic F127 to TPGS（X1）and the ratio polymer to drug（X2）on the particle size distribution（Y2）of AST-NMs

本研究要求制備的AST-NMs的包封率最大化,粒徑分布最小化,經實驗軟件預測得到AST-NMs的最優處方為:Pluronic F127與TPGS質量比為5∶1,聚合物與藥物質量比為38∶1,預測AST-NMs的包封率為98.7%,粒徑為35.0 nm。按照該處方制備3批AST-NMs,測定包封率為98.4%±1.5%,粒徑為（36.4±2.3）nm,與預測值較接近。

2.5 AST-NMs表征

2.5.1 DSC分析 通過DSC 分析AST 原料藥、TPGS、Pluronic F127、AST 原料藥與聚合物的物理混合物以及AST-NMs凍干粉,以確定AST在膠束中的存在形式。精密稱取上述5種樣品置于帶蓋的鋁鍋中,密封,在20℃～340℃范圍內以10℃·min-1的加熱速率進行分析,結果見圖3。

圖3 差示掃描量熱圖Fig.3 Differential scanning calorimetry

由圖3可知,AST 原料藥的吸熱峰約為296℃,TPGS和Pluronic F127分別約在46、34℃處出現吸熱峰,物理混合物中AST 約在296℃處出現吸熱峰,表明AST 以結晶態形式存在;AST-NMs的凍干粉中藥物吸熱峰消失,表明AST 為無定形態,藥物很可能以分子形式分散在聚合物中[7]。

2.5.2 微觀形態觀察 取1滴AST-NMs滴加到碳包覆的銅網格上,鋪展后用濾紙吸干多余液體,再滴加1滴磷鎢酸鈉溶液（2 mg·mL-1）,負染色5 min,室溫下干燥,通過透射電鏡在120.0 kV 加速電壓下觀察AST-NMs的微觀形態,見圖4。電鏡照片顯示,AST-NMs呈圓整的球狀,未發現聚集以及藥物結晶,粒徑大小在20～40 nm 范圍內分布,與納米粒度儀測量的結果相似。

圖4 AST-NMs的透射電鏡照片Fig.4 Transmission electron micrograph of AST-NMs

2.6 稀釋穩定性評價

膠束進入人體胃腸道中會被稀釋,存在藥物泄露的風險,因此需要通過體外稀釋實驗考察其稀釋穩定性[8]。采用pH1.2 鹽酸溶液、pH4.5 枸櫞酸溶液、pH6.8磷酸鹽緩沖液（PBS）以及pH7.4 PBS分別將AST-NMs稀釋200倍,在37℃水浴中恒溫保存,分別在0、2、4、6 h時間點觀察外觀,并取樣測定粒徑分布。每份樣品平行實驗3次,取平均值,結果見表4。

表4 AST-NMs稀釋穩定性結果 （n=3,）Tab.4 The dilution stability of AST-NMs （n=3,）

表4 AST-NMs稀釋穩定性結果 （n=3,）Tab.4 The dilution stability of AST-NMs （n=3,）

稀釋穩定性結果顯示,AST-NMs經不同pH 溶液稀釋,在考察的時間范圍內未出現絮凝分層以及藥物析出沉淀現象;樣品在放置過程中粒徑未發生顯著變化,說明AST-NMs經不同pH 溶液稀釋后穩定性良好,預示著AST-NMs在胃腸道內會長時間以完整的納米膠束形式存在,并最終進入體循環[9]。

2.7 體外藥物釋放

采用透析法評價AST-NMs的體外藥物釋放情況[10]。將AST-NMs 5 mL 置于處理好的透析袋中（截留相對分子質量為8～10 k Da）,系緊兩端,將樣品分別完全浸入pH1.2鹽酸溶液、pH4.5枸櫞酸溶液、pH6.8PBS以及pH7.4PBS（釋放介質中均含有質量濃度為5 mg·mL-1吐溫-80溶液）中,體積為245 mL,溫度為37℃,磁力攪拌速度為50 r·min-1,分別在固定的時間點（1、2、4、6、8、10、12、24 h）取出介質溶液5 mL,并補加對應的等體積空白釋放介質,上述釋放介質溶液經0.22μm 微孔濾膜過濾,稀釋適當倍數,HPLC-ELSD法檢測藥物含量,計算累積釋放度。見圖5。

圖5 AST-NMs在不同pH介質中的體外藥物釋放曲線 （n=6,）Fig.5 In vitro drug release curves of AST-NMs in different pH media （n=6,）

由圖5可知,AST-NMs在不同pH 釋放介質中藥物釋放速率基本一致,說明介質pH 不會對藥物釋放產生影響。在最初的2 h從AST-NMs釋放了約15%的藥物,后期藥物釋放較為緩慢,24 h后藥物釋放量約為60%。

2.8 Caco-2細胞單層滲透性研究

將生長狀態良好的密度為1.0×104個·mL-1的Caco-2細胞接種于Transwell 24孔微孔濾膜培養板上,加入培養基并在37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養,每隔48 h更換培養基,培養21 d后去除培養基,測量跨上皮電阻（TEER）值大于600Ω·cm-2,說明Caco-2細胞已經形成了完整和緊密的單細胞層[11],可用于轉運實驗。實驗開始時,Caco-2細胞單層用預熱（37℃）的空白漢克平衡鹽溶液（HBSS）洗滌3次。從頂端（AP）到基底外側（BL）轉運實驗操作如下:將AST溶液或AST-NMs（藥物質量濃度均為0.5 mg·mL-1）各0.5 mL添加到AP表面作為供給池,將HBSS（pH 7.4）1.5 mL添加到BL表面作為接收池;同樣,從基底外側（BL）到頂端（AP）轉運實驗操作如下:將AST 溶液或AST-NMs（藥物質量濃度均為0.5 mg·mL-1）各1.5 mL添加到BL表面作為供給池,將HBSS（pH 7.4）0.5 mL 添加到AP 表面作為接收池,分別在60、120、180和240 min從接收池中取出200μL 樣品溶液（同時補充等量的空白HBSS）,檢測藥物含量,按照下列公式計算表觀滲透系數（Papp）。每組實驗平行進行3次,取平均值。

其中d Q÷dt為單位時間內藥物轉運量,A 為轉運膜面積,C0為供給液中藥物的初始質量濃度,Papp（AP-BL）為藥物從AP 側到BL 側的表觀滲透率,Papp（BL-AP）為藥物從BL側到AP側的表觀滲透率。見表5。

表5 AST和AST-NMs在Caco-2細胞單層中的Papp 值 （n=3,）Tab.5 Apparent permeability c oefficients of AST and ASTNMs in Caco-2 cell monolayer（n=3,）

表5 AST和AST-NMs在Caco-2細胞單層中的Papp 值 （n=3,）Tab.5 Apparent permeability c oefficients of AST and ASTNMs in Caco-2 cell monolayer（n=3,）

實驗結果表明,AST 原料藥從AP側轉運至BL側,其Papp（AP-BL）值為（3.7±0.5）×10-6cm·s-1,從BL側轉運至AP側,其Papp（BL-AP）值為（9.6±0.6）×10-6cm·s-1,說明Caco-2單層細胞對AST 存在外排作用,AST 很可能是P-gp的底物[2];AST-NMs從AP側轉運至BL側,其Papp（AP-BL）值為（5.3±0.3）×10-6cm·s-1,從BL側轉運至AP側,其Papp（BL-AP）值為（4.2±0.4）×10-6cm·s-1,與AST 原料藥相比,AST-NMs明顯增加了藥物吸收,抑制了藥物外排,一方面是由于AST-NMs可通過胞飲作用被小腸上皮細胞吸收,減弱了肝臟首過效應[12],另一方面是由于AST-NMs中的TPGS可抑制P-gp的活性,減弱了其對AST 的外排作用[13]。

3 討論

研究表明,NMs可通過胞飲作用被完整地吸收到體循環中,其粒徑大小會影響吸收的速率和程度,粒徑小于10 nm 的納米膠束可以被腎臟過濾除掉,而大于100 nm 的納米膠束可以逃避內皮網狀系統（RES）識別,易被肝臟捕獲,實現體內的長循環作用[14],因此,納米膠束較為理想的粒徑在10～100 nm 范圍。本研究制備的AST-NMs粒徑在20～40 nm 之間,有利于逃避RES的識別并延長體內藥物作用時間。

P-gp是細胞膜中的主要轉運蛋白,它的功能是泵出有毒的外源性物質,維持機體正常生理功能[15],小腸上皮細胞中存在大量的P-gp,可能影響到部分藥物吸收[16]。TPGS是一種安全的表面活性劑,能抑制P-gp的活性[17]。因此,AST-NMs的處方中加入TPGS。Caco-2單層細胞滲透性實驗表明,ASTNMs能夠促進藥物吸收,減少藥物外排。通過本研究結果可以推測采用Pluronic F127和TPGS制備的納米膠束可以增大黃芪甲苷的口服生物利用度。