絡(luò)石藤中3個(gè)化合物與P38αMAPK 靶酶的分子對接研究

張 銘,張 莉,冉 挺,段緒紅,趙聰格,魏計(jì)超,蘇彥雷

1.石家莊平安醫(yī)院藥械科,石家莊 050000;2.廈門大學(xué)藥學(xué)院,廈門 361102;3.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,石家莊 050200;4.解放軍第260醫(yī)院藥械科,石家莊 050041;5.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,石家莊 050001;6.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院臨床藥學(xué)科,石家莊 050082

絡(luò)石藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,為抗風(fēng)濕中藥,化學(xué)成分包括木質(zhì)素類、黃酮類、萜類、生物堿類等化合物,現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其具有抗炎作用[1-2]。查閱石家莊平安醫(yī)院2019年～2020年治療類風(fēng)濕的中藥處方,分析后發(fā)現(xiàn)中藥絡(luò)石藤的臨床應(yīng)用頻率較高,此外,一些抗風(fēng)濕中成藥如通絡(luò)開痹片、舒筋活血膠囊等處方中也均含有絡(luò)石藤,但絡(luò)石藤相關(guān)的藥理研究報(bào)道多為粗提物,其發(fā)揮抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并未被明確闡釋。本研究選取絡(luò)石藤中牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡(luò)石苷元B為目標(biāo)化合物,以炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵激酶P38αMAPK 為研究靶點(diǎn)[3-11],參照其抑制劑SB-203580[12-13]、BIRB-796[14-17]與靶酶的分子間相互作用模式,利用分子對接軟件Autodock Vina探究牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡(luò)石苷元B與P38αMAPK的分子間作用結(jié)合模式。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元、牛蒡子苷與標(biāo)靶蛋白活性位點(diǎn)存在較強(qiáng)的相互作用,而絡(luò)石苷元B的相互作用較弱以至于不能穩(wěn)定地占據(jù)該活性位點(diǎn),故絡(luò)石苷元B對P38αMAPK 激酶無相關(guān)抑制作用。牛蒡子苷元和牛蒡子苷可競爭性阻斷靶酶活性位點(diǎn)與三磷酸腺苷（ATP）的結(jié)合,抑制靶酶的生物學(xué)活性,從而阻斷P38αMAPK 介導(dǎo)的炎癥通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制炎癥因子的生成,發(fā)揮抗炎藥理作用,本研究結(jié)果與牛蒡子苷元、牛蒡子苷的抗炎藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。牛蒡子苷元和牛蒡子苷應(yīng)該是中藥絡(luò)石藤發(fā)揮抗風(fēng)濕作用的活性代表成分,二者可能通過抑制P38αMAPK 炎癥通路而發(fā)揮抗炎藥理作用。本研究從分子間相互作用層面闡釋了二者的抗炎機(jī)制,研究得出了牛蒡子苷元、牛蒡子苷抗炎藥理作用的一個(gè)重要靶點(diǎn),亦為具有抗炎活性的新型p38α激酶抑制劑的設(shè)計(jì)提供了新的參考,值得進(jìn)行深入研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 小分子配體及靶標(biāo)蛋白的選擇

在分子對接實(shí)驗(yàn)過程中,選取絡(luò)石藤中的牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡(luò)石苷元B為分子對接的配體（見圖1）,設(shè)定經(jīng)典抑制劑SB-203580、BIRB-796為陽性對照配體,用以驗(yàn)證對接方法的科學(xué)性和可靠性,進(jìn)行與P38α的分子對接。小分子配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 小分子配體的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of smalll molecule ligands

P38MAPK激酶家族中的α亞型主要與炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),是近30多年來研究的一個(gè)重要抗炎靶點(diǎn)。P38αMAPK結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)與底物分子結(jié)合的空腔結(jié)合位點(diǎn)[18-21],如底物ATP 占據(jù)了靶酶結(jié)構(gòu)中的AB、SB、PB區(qū)域,抑制劑SB-203580則占據(jù)P38αMAPK 的AB區(qū)域、HP Ⅰ疏水區(qū)域、PB 區(qū)域;抑制劑BIRB-796占據(jù)HP Ⅰ疏水區(qū)域、HPⅡ區(qū)域、SP 區(qū)域、PB區(qū)域以及Phe169苯丙基移動(dòng)大約10?[22]后所暴露的變構(gòu)疏水口袋,BIRB-796嗎啉環(huán)上氧原子與靶酶Met109形成氫鍵,其脲上的氧原子與Asp168殘基形成氫鍵相互作用,脲中的氫原子與Glu71形成氫鍵相互作用,叔丁基結(jié)合在了變構(gòu)疏水口袋,倘若將BIRB-796的叔丁基換為甲基則活性降低1 000倍以上。靶酶與SB-203580共結(jié)晶所得結(jié)構(gòu)為1A9U,稱為DFG-in構(gòu)象;與BIRB-796 共結(jié)晶所得結(jié)構(gòu)為1KV2,稱為DFG-out構(gòu)象。1A9U 與1KV2是同一蛋白的2 種不同構(gòu)象,將兩者結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維空間上的疊合,區(qū)別僅在于1KV2較1A9U 多出一個(gè)便于底物結(jié)合的疏水空腔,即DFG-out構(gòu)象中Phe169的苯環(huán)從親脂口袋外翻并指向了ATP 結(jié)合區(qū)域從而暴露出了變構(gòu)疏水口袋,DFG 基序所在的活化環(huán)域（A-loop）略微向外翻騰。見圖2。此外,分析發(fā)現(xiàn),HPⅠ疏水區(qū)域由Val38、Ala51·12345678s53、Leu75、Leu104、Thr106等組成[23-25],HPⅡ空腔區(qū)域由Val30、Ala40、Ile84、Leu108、Ala111、Asp112、Met109 等組成[24,26],變構(gòu)疏水口袋由Leu74、Met78、Val83、Ile141、Ile166 等組成[27]。

圖2 1KV2與1A9U 的三維結(jié)構(gòu)疊合Fig.2 The overlap of three dimensional structure between 1KV2 and 1A9U

考慮配體分子的柔性變化和體積較大,故選定1KV2 為本研究中進(jìn)行分子對接的靶標(biāo)蛋白,將BIRB-796、牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡(luò)石苷元B 與其進(jìn)行分子對接研究,此外,將SB-203580與1a9u進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn),2個(gè)陽性對照配體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別與原有結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行三維空間的疊合用以驗(yàn)證對接方法是否具有科學(xué)性、可靠性。

1KV2三維結(jié)構(gòu)主要由8個(gè)α螺旋、9個(gè)β折疊及無規(guī)卷曲組成,有生物學(xué)活性作用的位點(diǎn)主要由β折疊及2個(gè)螺旋及無規(guī)卷曲組成。蛋白疏水的溝槽位于蛋白的表面,小分子抑制性配體結(jié)合于此活性位點(diǎn)妨礙正常底物的進(jìn)入與結(jié)合,從而起到阻斷炎癥信號通路傳導(dǎo)的作用。

1.2 分子對接及運(yùn)算過程

本實(shí)驗(yàn)的研究方法采用筆者之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法[28]。

1.2.1 配體處理 利用Chemdraw 14.0處理小分子的結(jié)構(gòu),采用MM2力場進(jìn)行能量最小化優(yōu)化保存成mo12格式,用MGLTools1.5.6處理,通過加氫,計(jì)算電荷及合并非極性氫后保存成pdbqt文件。

1.2.2 受體處理 從PDB 數(shù)據(jù)庫獲得蛋白三維結(jié)構(gòu),用MGLTools1.5.6處理蛋白結(jié)構(gòu),通過加氫、計(jì)算電荷、合并非極性氫后保存成pdbqt文件。

1.2.3 利用分子對接軟件Autodock Vina進(jìn)行對接處理 以蛋白的活性位點(diǎn)（centerx=33.326,centery=33.725,centerz=17.372）為中心,構(gòu)建一個(gè)60×40×60的盒子,通過Vina運(yùn)算生成pdbqt文件。

1.2.4 結(jié)果處理 Py MOL1.7.2.1 軟件打開生成pdbqt文件,并打開1KV2蛋白結(jié)構(gòu),保存成復(fù)合物pdb文件,并進(jìn)行相關(guān)作圖處理與分析。

2 分子對接的結(jié)果及分析

2.1 陽性化合物的對接結(jié)果

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,SB-203580 和BIRB-796 均結(jié)合于原活性位點(diǎn)處,配體BIRB-796的對接構(gòu)象與原晶體構(gòu)象疊合時(shí),均方根偏差（RMSD）計(jì)算為0.426?,配體SB-203580的對接構(gòu)象與原晶體構(gòu)象疊合時(shí)RMSD 計(jì)算為0.867,均小于2,說明對接結(jié)果是相對可靠的。見圖3和圖4。此外,BIRB-796、SB-203580 對接時(shí)產(chǎn)生的結(jié)合能分別為-11.0、-8.9 kal·mol-1,說明BIRB-796 與P38αMAPK 的結(jié)合能力強(qiáng)于SB-203580,這也與實(shí)際藥理實(shí)驗(yàn)中BIRB-796對P38α的抑制活性明顯強(qiáng)于SB-203580的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[27]一致。

圖3 BIRB-796與靶標(biāo)蛋白1KV2的對接配體對接構(gòu)象（綠）與原晶體構(gòu)象（紫）疊合Fig.3 The docking conformation （green）of BIRB-796 with the docking ligand of the target protein 1KV2 overlaps with the original crystal conformation （purple）

圖4 SB-203580與靶標(biāo)蛋白1A9U 的對接配體對接構(gòu)象（綠）與原晶體構(gòu)象（紫）疊合Fig.4 The docking conformation （green）of SB-203580 with the docking ligand of target protein 1A9U overlaps with the original crystal conformation（purple）

2.2 目標(biāo)化合物對接結(jié)果

通過分析Vina對接結(jié)果發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元、牛蒡子苷、絡(luò)石苷元B 與p38αMAPK 的上述結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生一定的相互作用,小分子配體結(jié)合于1KV2蛋白,以pymol作圖,蛋白以cartoon形式顯示,對接結(jié)果見圖5。

圖5 牛蒡子苷元（1）、牛蒡子苷（2）、絡(luò)石苷元B（3）結(jié)合于1KV2的示意圖Fig.5 The binding mode of arctigenin（1）,arctiin（2）,trachelosperogenin B（3）with 1KV2

通過分析Vina對接結(jié)果發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元配體主要通過疏水、范德華力結(jié)合于1KV2結(jié)構(gòu)中的活性位點(diǎn),主要與Lys53、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Ile147、Arg149、His148、Ile166、Leu167、Asp168、Phe169 等氨基酸殘基發(fā)生相互作用（見圖6）,推測牛蒡子苷元占據(jù)了p38α的PB區(qū)域、變構(gòu)疏水口袋及其他新區(qū)域,與1KV2靶點(diǎn)蛋白對接產(chǎn)生的能量為-8.3 kal·mol-1。

圖6 牛蒡子苷元配體結(jié)合1KV2蛋白（a）與結(jié)合二維平面（b）示意圖Fig.6 The docking of arctigenin with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

牛蒡子苷配體主要通過疏水、范德華力結(jié)合于1KV2結(jié)構(gòu)中的活性位點(diǎn);主要與Tyr35、Leu55、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Ile147、His148、Arg149、Leu167、Asp168、Phe169、Glu328等氨基酸殘基發(fā)生相互作用（見圖7）,小分子配體的羥基氫和Glu71氧原子形成氫鍵,鍵長為2.7?;糖環(huán)上的氫與Phe169上的氧形成氫鍵,氫鍵鍵長2.5?,推測牛蒡子苷占據(jù)p38α的PB區(qū)域、變構(gòu)疏水口袋及其他新區(qū)域,對接能量為-8.0 kal·mol-1。

圖7 牛蒡子苷配體結(jié)合1KV2蛋白（a）與結(jié)合二維平面（b）示意圖Fig.7 The docking of arctiin with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

絡(luò)石苷元B 配體主要通過疏水、范德華力結(jié)合于1KV2結(jié)構(gòu)中的活性位點(diǎn);主要與Arg67、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Arg149、His148、Ile166、Leu167和Asp168等氨基酸殘基發(fā)生相互作用（見圖8）,小分子配體的羥基氫和Asp168氧原子形成氫鍵,鍵長為2.1?;與His148上的N 形成氫鍵,鍵長為2.2?,推測絡(luò)石苷元B 占據(jù)p38αMAPK 的變構(gòu)疏水口袋及其他新區(qū)域,對接能量為-4.4 kal·mol-1。

圖8 絡(luò)石苷元B配體結(jié)合1KV2蛋白（a）與結(jié)合二維平面示意圖（b）Fig.8 The docking of collagenin B with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

3 結(jié)論

P38MAPK（α亞型）是一個(gè)國際公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥通路信號傳遞的激酶,至今已有幾十年的研究歷史,對P38α激酶進(jìn)行抑制可減少炎癥因子生成從而產(chǎn)生抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用,例如SB-203580、BIRB-796等P38αMAPK 抑制劑均可在細(xì)胞水平降低LPS刺激而誘導(dǎo)多種炎癥因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等）的生成,但多個(gè)P38α激酶的強(qiáng)效抑制劑均以臨床試驗(yàn)失敗而告終,原因在于P38α激酶的生物學(xué)作用廣泛,所以P38α激酶的弱作用抑制劑或者其下游炎癥通路的激酶可能應(yīng)該更適合作為研究抗炎作用的方向。本研究通過分子對接手段發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元和牛蒡子苷均是以非共價(jià)鍵結(jié)合方式作用于靶蛋白P38α的PB區(qū)域活性位點(diǎn)、變構(gòu)疏水口袋,均能競爭性的抑制P38α靶酶從而抑制該酶下游底物分子的活化,阻礙炎癥通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到抗炎作用,且二者對接結(jié)合能與SB-203580相接近,推測牛蒡子苷元和牛蒡子苷對P38αMAPK 的抑制活性極可能與SB-203580相近。絡(luò)石苷元B占據(jù)p38α的變構(gòu)疏水口袋及其他活性位點(diǎn)以外的新區(qū)域,并未作用于ATP的結(jié)合活性位點(diǎn),故對于ATP與p38α激酶的結(jié)合無競爭性抑制作用,并且與P38α激酶的結(jié)合作用較弱,故推測絡(luò)石苷元B 對P38α靶酶無抑制作用。而后續(xù)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),有多個(gè)藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[29-34],牛蒡子苷元和牛蒡子苷具有抗炎作用,即二者可抑制脂多糖LPS誘導(dǎo)下的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多種炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等）,藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果與筆者的研究結(jié)論相一致,但二者發(fā)揮抗炎作用的靶酶及作用機(jī)制并未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從分子間相互作用的角度,闡釋了二者抗炎藥理作用的機(jī)制,牛蒡子苷元和牛蒡子苷與P38αMAPK 的活性位點(diǎn)存在較好的分子間結(jié)合作用,可競爭性阻礙該活性位點(diǎn)與ATP 的結(jié)合,能通過抑制P38αMAPK 而發(fā)揮減少炎癥因子生成的抗炎作用,同時(shí)也為P38αMAPK 新型抑制劑的設(shè)計(jì)及進(jìn)一步的分子結(jié)構(gòu)改造提供了一定的參考價(jià)值。新頒布的藥品法也再次強(qiáng)調(diào)了藥品創(chuàng)新的重大意義,并且也指出中醫(yī)藥是現(xiàn)階段創(chuàng)新研究的巨大資源寶庫,故利用現(xiàn)代化技術(shù)手段,發(fā)掘中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分,推動(dòng)藥物創(chuàng)新,這也正是當(dāng)代科學(xué)研究人員應(yīng)該做的工作。