不同菌種對太和豆豉的品質及其揮發性風味化合物變化的研究

何維，安天星，余玲，廖柯，唐揚，劉迎濤，鄧婷，黃才森，趙志峰

(1.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065；2.成都太和坊釀造有限公司，成都 610501)

豆豉通常是以黃豆、黑豆等豆類物質為原料，經浸泡、蒸煮、制曲、拌料、后發酵而成[1]。按照微生物發酵的種類不同，可分為毛霉型、曲霉型、根酶型、細菌型及脈胞菌型五大類，其中毛霉豆豉以重慶潼川、四川永川、四川太和豆豉為典型代表[2-3]。豆豉在發酵成熟的過程中發生著復雜的化學變化，其中主要包括還原糖、蛋白質、脂肪酸等含量的變化，使豆豉口感細膩綿軟[4-5]。其中最主要的變化是豆豉中的蛋白質被分解為小分子的游離氨基酸與多肽，不但提高了食品的營養價值，還決定了發酵食品的滋味與風味物質的形成[6-11]。毛霉豆豉因具有獨特的多種生理活性物質與獨特的風味，且具有一定的藥用價值與食用價值，深受消費者的歡迎。

毛霉型豆豉是我國傳統的大豆發酵制品，一直深受人們的喜愛[12]。且大豆在微生物作用下不僅能很好地保留大豆原有的營養成分，而且在其他微生物(如乳酸菌、酵母菌)的發酵過程中能產生一定量的大豆異黃酮、大豆抗氧化肽、大豆低聚糖、活性酶和亞麻酸等活性成分，具有抗癌、抗氧化、降血脂、調理腸胃等生理功能[13-14]。豆豉發酵過程中還原糖、氨基酸、風味物質等變化規律和特點有利于分析其產品品質形成的機理。目前，四川太和豆豉產品品質形成機理還未見報道。

本試驗將總狀毛霉(Mucorracemosus)、米曲霉、總狀毛霉與米曲霉混合后以及接種于黃豆中，通過測定不同發酵時期的還原糖、總酸、氨基態氮，再通過氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法測定不同發酵時期豆豉中風味物質含量的變化。探討不同菌種在太和豆豉發酵過程中基本成分的發酵規律，從而為進一步推廣高品質的毛霉型太和豆豉提供可靠的研究數據支持，為毛霉豆豉工業化、標準化生產提供研究數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

總狀毛霉M-THF-02：已保藏于中國典型培養物保藏中心；米曲霉3.042：購于山東沂源康源生物科技有限公司。

黃豆：產地黑龍江省訥河市。

硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、三氯乙酸、乳酸鈉、葡萄糖等試劑(均為分析純)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、麥麩培養基：成都鴻盛達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

試驗儀器見表1。

表1 主要儀器設備一覽表Table 1 The main instruments and equipment

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1.3 試驗方法

1.3.1 不同菌種豆豉的制備

純種毛霉豆豉的制作：大豆除雜→清洗→浸泡→常壓蒸煮→冷卻→接種→前發酵(25 ℃、72 h)→拌和(10%食鹽、1%白酒、)→入池后發酵(常溫發酵時間300 d以上)→成品。

米曲霉豆豉的制作：大豆除雜→清洗→浸泡→常壓蒸煮→冷卻→接種→前發酵(28 ℃、42 h)→拌和(10%食鹽、1%白酒)→入池后發酵(常溫發酵時間200 d以上)→成品。

米曲霉與毛霉混合發酵豆豉的制作：大豆除雜→清洗→浸泡→常壓蒸煮→冷卻→接種→前發酵(前期發酵溫度為25 ℃，48 h，后期發酵溫度為28 ℃)→拌和(10%食鹽、1%白酒)→入池后發酵(常溫發酵時間250 d以上)→成品。

將上述制備好的豆豉每隔30 d取樣測定其氨基態氮、總酸、還原糖含量以及風味物質含量。

1.3.2 理化指標的測定

1.3.2.1 豆豉中還原糖含量的測定

以葡萄糖的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程：y=0.5002x-0.001，相關系數R2=0.9996 。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定豉曲的還原糖含量。

1.3.2.2 豆豉中氨基酸態氮、總酸含量的測定

參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》，采用甲醛法測定氨基酸態氮與總酸含量。

1.3.2.3 豆豉中香味物質的提取方法

香味物質采用頂空固相微萃取技術進行提取[15]，取不同發酵時期的豆豉樣品5.0 g于20 mL的頂空瓶內，蓋上瓶蓋，置于60 ℃恒溫水浴鍋中平衡20 min，采用固相微萃取裝置將萃取頭手動插入頂空瓶中，頂空吸附20 min后，直接將萃取頭注入氣相色譜儀進樣口處，在230 ℃條件下脫附5 min。

1.3.2.4 香味物質的分析鑒定方法

采用氣相色譜-質譜分析法(GC-MS)對提取出來的香味物質進行分析。

氣相色譜(GC)條件：采用 DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，用氦氣作載氣，流速為1.0 mL/min。升溫程序：色譜柱起始柱溫40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升到230 ℃，保持5 min。

質譜(MS)條件：采集方式：全掃描，質量采集范圍 40～400 m/z；電離方式：電子轟擊(EI)；發射能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：230 ℃。

1.3.2.5 豆豉香味物質分析定量方法

采用面積歸一法定量，通過豆豉中各組分的峰面積與各組分峰面積總和的比值來表示，按下式計算各個組分的相對含量：

式中：Ci為待測組分i的含量；Ai為待測組分i的峰面積；Si為各組分峰面積之和。

2 結果與分析

2.1 不同菌種豆豉發酵過程中理化指標的變化

由圖1～圖3中3種不同菌種豆豉在發酵過程中的變化趨勢可以看出，3種豆豉在發酵過程中總酸與氨基態氮的含量都呈現出上升的趨勢，而還原糖的生成速率呈現下降的趨勢，其主要有兩方面的原因：一方面，由于微生物的生長，消耗速率增加，從而導致豆豉還原糖含量降低[16]；另一方面，由于豆豉本身在發酵過程中環境所帶微生物代謝糖類等物質形成乳酸和乙酸等有機酸，這也是導致還原糖含量降低的原因[17]。3種豆豉在常溫發酵過程中，氨基態氮含量、總酸含量由高到低的順序為米曲霉豆豉>毛霉與米曲霉混合發酵豆豉>毛霉豆豉；其主要原因是毛霉菌種與米曲霉發酵過程中產生的酶活力不同，毛霉豆豉主要以酸性蛋白酶為主；米曲霉豆豉主要以產生中性蛋白酶為主，這些主要成分的差異也有可能導致這3種豆豉口味不同，毛霉豆豉的風味明顯高于米曲霉豆豉。

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c

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b

c

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2.2 不同菌種發酵豆豉中香味物質分析結果

圖4 不同菌種發酵豆豉香味物質總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

表2 不同菌種發酵豆豉香味物質對比Table 2 Comparison of flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

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由圖5和圖6可知，豆豉1號共檢測出55種香味物質，其中烴類10種，占總相對含量的2.83%；醇類10種，占總相對含量的37.03%；醚類1種，占總相對含量的0.44%；酮類2種，占總相對含量的0.24%；醛類6種，占總相對含量的8.05%；酸類1種，占總相對含量的3.45%；酯類20種，占總相對含量的46.98%；吡咯類1種，占總相對含量的0.13%；吡嗪類2種，占總相對含量的0.76%；其他類2種，占總相對含量的0.10%。豆豉2號共檢測出64種香味物質，其中烴類20種，占總相對含量的3.7%；醇類11種，占總相對含量的25.73%；醚類1種，占總相對含量的9.51%；酮類1種，占總相對含量的0.07%；醛類6種，占總相對含量的6.20%；酸類2種，占總相對含量的4.08%；酯類21種，占總相對含量的50.54%；吡咯類1種，占總相對含量的0.04%；吡嗪類1種，占總相對含量的0.12%。豆豉3號共檢測出76種香味物質，其中烴類26種，占總相對含量的18.54%；醇類10種，占總相對含量的17.35%；醚類3種，占總相對含量的17.62%；酮類2種，占總相對含量的1.03%；醛類10種，占總相對含量的6.98%；酯類22種，占總相對含量的37.91%；吡咯類1種，占總相對含量的0.45%；其他類2種，占總相對含量的0.11%。

圖5 不同菌種發酵豆豉中不同種類香味物質相對含量統計圖Fig.5 Statistical chart of relative content of different flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

圖6 不同菌種發酵豆豉中不同種類香味物質種數統計圖Fig.6 Statistical chart of species number of differentflavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

這3種不同菌種發酵的豆豉主要的香味物質種類為烴類、醇類、醚類、酮類、醛類、酯類和吡咯類；3種豆豉香味物質種類占比最高的均為酯類。

2.3 不同菌種發酵豆豉中主體香味物質分析

為了進一步分析3種不同菌種發酵的豆豉香味物質的差異，選取每種豆豉中檢測到的香味物質相對含量≥1%的物質單獨剔除進行分析，結果見表3。

表3 不同菌種發酵豆豉主體香味物質分析Table 3 Analysis of main flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

由圖7可知，3種豆豉主體香味物質種數分別為14，19，17種，主體物質總相對含量分別為84.49%、93.38%和92.27%。

圖7 不同菌種發酵豆豉主體香味物質總相對含量和種數分析Fig.7 Analysis of total relative content and species number of main flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

3種豆豉所含主體香味物質種類均包括烴類、醇類、醛類和酯類，除此以外，豆豉1號所含主體香味物質種類還包括醚類，豆豉2號包括醚類和酸類，豆豉3號包括酸類。(+)-檸檬烯為3種樣品共有的烴類主體香味物質，(+)-檸檬烯具有類似檸檬的香味；芳樟醇為3種樣品共有的醇類主體香味物質，芳樟醇具有鈴蘭香氣；苯甲醛和苯乙醛為3種樣品共有的醛類主體香味物質，其中苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香，苯乙醛具有類似風信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣；己酸乙酯、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯和安息香酸乙酯為3種樣品共有的酯類主體香味物質，其中己酸乙酯具有酒曲香、菠蘿香型的香氣，苯乙酸乙酯具有濃烈而甜的蜂蜜香氣，十六酸乙酯具有微弱蠟香、果爵和奶油香氣，安息香酸乙酯具有水果氣味。

綜上所述，3種豆豉所含主體香味物質種類均包括烴類、醇類、醛類和酯類，除此以外，豆豉1號所含主體香味物質種類還包括醚類，豆豉2號包括醚類和酸類，豆豉3號包括酸類。豆豉1號呈現出較濃的茴香、酒曲香和稍淡的檸檬香、鈴蘭香以及淡淡的水果香、油脂香；豆豉2號呈現出較濃的微帶果香的酒香和稍淡的茴香、酒曲香以及淡淡的果香和鈴蘭香；豆豉3號呈現出濃郁的酒香和稍淡的酒曲香、辛辣蘋果白蘭地香氣以及淡淡的水果香和青草香。

3 結論

本文以毛霉豆豉、米曲霉豆豉、毛霉+米曲霉型豆豉為研究對象，研究3種不同菌種對太和豆豉中的還原糖、總酸、氨基態氮理化指標的影響，以及進行發酵過程中風味物質變化的測定。結果顯示：3種不同菌種對在豆豉發酵1～7個月過程中，米曲霉豆豉、毛霉豆豉、米曲霉+毛霉豆豉中的總糖含量呈逐漸下降的趨勢，而總酸與氨基態氮的含量呈現上升的趨勢；其主要原因是豆豉在后發酵過程中在蛋白水解酶的作用下將蛋白質與多肽進一步分解為游離氨基酸。采用GC-MS測定3種不同菌種發酵的太和豆豉中的揮發性成分，其中在毛霉豆豉中檢測出76種揮發性成分，米曲霉豆豉中有55種揮發性成分，米曲霉+毛霉豆豉中有64種揮發性成分，3種豆豉中最主要的成分包括烴類、醇類、醚類、酮類、醛類、酯類和吡咯類。毛霉豆豉的風味物質明顯高于米曲霉豆豉與毛霉+米曲霉豆豉，其原因可能是毛霉豆豉發酵周期長，成熟期較長，其酶主要產酸性蛋白酶，而米曲霉以中性蛋白酶為主；但其品質與口感明顯高于米曲霉豆豉，這也是消費者喜歡毛霉豆豉的原因。通過對不同菌種在太和豆豉發酵過程中理化指標的動態分析以及風味物質的分析，從而對太和豆豉的發酵過程有了進一步的了解，同時也為豆豉發酵過程奠定了理論基礎。研究表明，傳統發酵食品如泡菜、豆醬、醬油等食品的風味物質主要取決于發酵過程中酵母菌與乳酸菌的作用[18-19]。對豆豉發酵后菌群研究表明，乳酸菌與酵母在豆豉發酵后也占主體地位，而且對豆豉色澤、香味起著重大的意義[20]。太和豆豉風味的形成是微生物代謝及食物組分相互作用的結果，其微生物菌群的變化和各種風味物質形成的機理還需進一步探討與研究，以期為指導豆豉的工業化與規?；a提供更多的理論基礎。