基于計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)從天然產(chǎn)物中篩選PPARγ激動(dòng)劑

劉治國(guó) 崔文強(qiáng) 魏葉 朱心瑤 楊雪

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷第一人民醫(yī)院宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷 223800；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；3徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 221004

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）在脂肪細(xì)胞分化、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性等糖脂代謝方面中發(fā)揮著重要作用［1?2］。噻唑烷二酮類藥物（TZDs），如羅格列酮和吡格列酮，是合成的PPARγ激動(dòng)劑，主要用于治療2型糖尿病［3?4］。雖然此類藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用［5?6］，但TZDs目前仍然是臨床上用于改善胰島素抵抗的重要藥物［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物具有較好的抗糖尿病活性且?guī)缀鯖](méi)有副作用，因此從植物來(lái)源的天然化合物庫(kù)中尋找潛在的藥物先導(dǎo)化合物或膳食補(bǔ)充劑成為研究熱點(diǎn)［8?11］。PPARγ是抗糖尿病藥物非常有吸引力的分子靶標(biāo)，因此尋找新的PPARγ激動(dòng)劑以增強(qiáng)其有益作用并減少不良反應(yīng)仍有很高的研究?jī)r(jià)值。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（computer?aided drug design，CADD）是通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬藥物與受體之間的關(guān)系，是設(shè)計(jì)和優(yōu)化先導(dǎo)化合物的重要方法，其中包括活性位點(diǎn)分析、數(shù)據(jù)庫(kù)虛擬篩選和全新藥物設(shè)計(jì)等［12］。近20年來(lái)，以分子對(duì)接為代表的基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選（virtual screening，VS）已成為基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)方法。當(dāng)前基于結(jié)構(gòu)的CADD廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)［13?14］，并可預(yù)測(cè)小分子藥物與PPARγ靶點(diǎn)的親和力，進(jìn)而反映其抗糖尿病的潛力，其中一些已表現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果［15］。從植物來(lái)源的天然化合物庫(kù)中進(jìn)行虛擬篩選具有高效、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，不僅可以減少藥物篩選的盲目性，減少研究開發(fā)時(shí)間，還可以大大節(jié)約研究費(fèi)用［16］。

2021年1月至9月，本研究中，筆者以PPARγ為關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分子模擬的方式對(duì)植物來(lái)源的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，并最終通過(guò)高精度分子對(duì)接篩選出天然小分子PPARγ激動(dòng)劑橙皮苷，為開發(fā)新的PPARγ激動(dòng)劑或膳食補(bǔ)充劑提供有效的策略與思路。

材料與方法

1、軟件

本研究運(yùn)用的軟件有SYBYL、OpenBabel和PyMol軟件。

2、小分子數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)備

本研究中，使用TargetMol公司的Natural Compound Library天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（全部可以購(gòu)買對(duì)應(yīng)的小分子標(biāo)準(zhǔn)品），其中共包含1 680個(gè)小分子化合物。首先使用OpenBabel軟件將小分子化合物的sdf格式轉(zhuǎn)化成可用于計(jì)算機(jī)分子模擬的mol2格式文件［17］，備用。

3、靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備與驗(yàn)證

通過(guò)PDB蛋白晶體數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載PPARγ的晶體結(jié)構(gòu)（PDB Code：6md4），通過(guò)Discovery Studio 4.1 Visualizer對(duì)其進(jìn)行編輯［18］，刪除蛋白中所有結(jié)晶水分子，并最終保留含有活性中心的蛋白A鏈，并通過(guò)SAVES（https：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）服務(wù)器的Procheck程序?qū)Φ鞍捉Y(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證以保證后續(xù)計(jì)算的可靠性。

4、計(jì)算機(jī)虛擬篩選

SYBYL是一種基于經(jīng)驗(yàn)（empirical?based）評(píng)分的對(duì)接程序［19］。首先通過(guò)Ligand Preparation模塊以及對(duì)前面獲得的mol2格式的小分子化合物進(jìn)行加氫和動(dòng)力學(xué)優(yōu)化處理，選取蛋白中配體進(jìn)行錨定的方法確定PPARγ的活性口袋，采用SYBYL中的Surflex?Dock Screen虛擬篩選模塊對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，其中將配體小分子作為參比分子。結(jié)果根據(jù)總分由高到低排序，查看小分子化合物與靶點(diǎn)活性位點(diǎn)的實(shí)際結(jié)合情況，選取排名前20的化合物進(jìn)行下一步的高精度分子對(duì)接。

5、分子對(duì)接計(jì)算

首先對(duì)排名前20的化合物進(jìn)行加氫和動(dòng)力學(xué)優(yōu)化，并使用虛擬篩選時(shí)確定的活性區(qū)域，采用SYBYL中的Surflex?Dock GeomX高精度模塊對(duì)小分子進(jìn)行高精度分子對(duì)接，即采用受體蛋白基本剛性、配體柔性的分子對(duì)接策略進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果根據(jù)評(píng)分由高到低排序，綜合沖突（crash）、極性（polar）和相似度（similarity）（與原型配體的相似度）因素，查看小分子化合物與活性位點(diǎn)的實(shí)際結(jié)合情況，選取結(jié)合穩(wěn)定的化合物進(jìn)行結(jié)合并使用PyMol軟件分析作圖［20］。

結(jié) 果

1、蛋白結(jié)構(gòu)圖與蛋白結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

通過(guò)PyMol軟件對(duì)PPARγ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了可視化，如圖1A所示。隨后筆者通過(guò)Procheck蛋白模型對(duì)準(zhǔn)確性進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)對(duì)118種分辨率≥2.0?、R因子≤20%的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在最適區(qū)域的氨基酸占比達(dá)到了94%，可允許區(qū)域的氨基酸占比是6%（圖1B）。而一個(gè)高質(zhì)量的模型在最優(yōu)區(qū)域應(yīng)該有超過(guò)90%的氨基酸殘基［21］，結(jié)果表明PPARγ三級(jí)模型結(jié)構(gòu)合理，整個(gè)PPARγ結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)均具有高質(zhì)量性，從而保證了后續(xù)計(jì)算研究的準(zhǔn)確性。

2、蛋白活性位點(diǎn)的確認(rèn)

圖1 PPARγ結(jié)構(gòu)圖與拉氏圖；A：PPARγ蛋白結(jié)構(gòu)圖；B：PPARγ蛋白結(jié)構(gòu)驗(yàn)證拉氏圖

在穩(wěn)定可靠的三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對(duì)蛋白靶點(diǎn)活性位點(diǎn)的準(zhǔn)確定位是虛擬篩選之前做的另一項(xiàng)極其重要的工作。利用軟件通過(guò)選取晶體蛋白結(jié)構(gòu)中配體進(jìn)行錨定的方法確定PPARγ的活性位點(diǎn)信息，最終確定活性位點(diǎn)的坐標(biāo)信息如下：X 18.21，Y 63.80，Z 13.81，半徑10?。配體錨定的活性區(qū)域如圖2所示。

3、虛擬篩選結(jié)果

基于得到的PPARγ的三維空間結(jié)構(gòu)（圖1），從上市藥物庫(kù)中篩選小分子PPARγ的潛在激動(dòng)劑，選取蛋白結(jié)構(gòu)中已知小分子作為篩選的結(jié)合位點(diǎn)，利用Sybyl?X2.1的Surflex模塊進(jìn)行虛擬篩選。對(duì)虛擬篩選結(jié)果的選擇也十分重要，要充分考慮虛擬篩選對(duì)接結(jié)果的評(píng)分排名。本研究的篩選條件是虛擬篩選結(jié)果排名前20的化合物。

4、分子對(duì)接結(jié)果

隨后對(duì)虛擬篩選的前20名化合物進(jìn)行了高精度分子對(duì)接，見(jiàn)表1。筆者發(fā)現(xiàn)橙皮苷可與PPARγ的Ser289、His323、Tyr327、Leu340、Glu343、His449、Tyr473形成氫鍵，作用距離短，作用力較強(qiáng)。以上對(duì)接結(jié)果充分說(shuō)明小分子橙皮苷與靶點(diǎn)PPARγ可以相互作用，有著良好的親和力，如圖3所示。

圖2 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ蛋白活性位點(diǎn)

討 論

2型糖尿病的主要特征是胰島素抵抗，以PPARγ為靶點(diǎn)開發(fā)出羅格列酮和吡格列酮是治療肥胖2型糖尿病患者的代表性藥物。羅格列酮由于其心臟不良反應(yīng)曾被黑框警示，雖然后來(lái)又撤銷了警示［22］，但其臨床應(yīng)用受到了影響，而吡格列酮目前仍在臨床應(yīng)用，表明PPARγ激動(dòng)劑在治療2型糖尿病方面仍有重要的價(jià)值［7，23?24］。眾所周知，我國(guó)中藥資源豐富，并且具有悠久的歷史，從天然產(chǎn)物中篩選先導(dǎo)化合物，再對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改造是一種重要的藥物開發(fā)途徑［25?27］。

圖3 橙皮苷與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ相互作用圖

表1 分子對(duì)接結(jié)果

在對(duì)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選之前需要做大量的準(zhǔn)備工作，包括對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)評(píng)估與驗(yàn)證來(lái)確定穩(wěn)定可靠的三維蛋白結(jié)構(gòu)。如果蛋白質(zhì)和配體均可用，基于蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行以分子對(duì)接為代表的虛擬篩選是可行的，但關(guān)鍵問(wèn)題是蛋白結(jié)構(gòu)是否可用，所報(bào)道的結(jié)構(gòu)是否可靠。如果蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載，就必須考慮X射線或核磁共振時(shí)的蛋白解析分辨率和獲得蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)時(shí)的條件［28］。分子識(shí)別是配體結(jié)合生物大分子的基礎(chǔ)，蛋白晶體結(jié)構(gòu)本身存在的問(wèn)題可能會(huì)影響基于蛋白結(jié)構(gòu)的分子模擬的結(jié)果，因此對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估與驗(yàn)證是十分有必要的。本研究的PPARγ三維模型結(jié)構(gòu)合理，保證了后續(xù)的虛擬篩選和分子對(duì)接足夠準(zhǔn)確。采用的surflex分子對(duì)接方法商業(yè)認(rèn)可度高，且該方法在可行性、準(zhǔn)確度及成功率方面都明顯優(yōu)于常用的開源分子對(duì)接方法。

本研究發(fā)現(xiàn)的小分子橙皮苷與靶點(diǎn)PPARγ可以相互作用，有著良好的親和力。Mahmoud［29］研究顯示橙皮苷可通過(guò)上調(diào)PPARγ消除氧化應(yīng)激和炎行反應(yīng)來(lái)減輕磷酰胺誘導(dǎo)的肝毒性，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)橙皮苷通過(guò)PPARγ途徑還可預(yù)防肝癌［30］，表明橙皮苷可激活PPARγ，減輕氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。Agrawal等［31］研究顯示橙皮苷可通過(guò)PPARγ途徑在糖尿病大鼠缺血性心臟病模型中產(chǎn)生心臟保護(hù)活性；Bhargava等［32］研究表明橙皮苷通過(guò)激活PPARγ產(chǎn)生抗炎、抗凋亡和抗氧化作用，從而逆轉(zhuǎn)心臟肥大。這些研究均顯示橙皮苷可通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。還有研究顯示：橙皮苷通過(guò)激活PPARγ預(yù)防糖尿病大鼠應(yīng)激性胃潰瘍［33］，還能夠通過(guò)增加PPARγ表達(dá)，抑制NF?κB介導(dǎo)的炎癥，減輕呼吸機(jī)誘發(fā)的急性肺損傷［34］。許多研究已證實(shí)橙皮苷可通過(guò)PPARγ途徑發(fā)揮作用，說(shuō)明本研究結(jié)果可靠。基于上述分子對(duì)接研究結(jié)果，本課題組研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷能調(diào)節(jié)糖脂代謝減輕胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，減少心肌膠原分泌，改善心肌纖維化［35］。

本研究為開發(fā)新的PPARγ激動(dòng)劑作為藥物或膳食補(bǔ)充劑用于預(yù)防和治療2型糖尿病提供了新的策略與思路。此外，筆者選擇的TargetMol公司的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)所有化合物均已商業(yè)化，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突