ATP6V1C1在肝細胞癌中的表達及功能研究

姜敏 趙玉軍

廣東省第二人民醫院普外二科，廣州 510317

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球每年新發腫瘤第7位，2020年新增905 677例，占全部新發腫瘤4.7%，死亡病例830 180例，占癌癥相關死亡病例的8.3%，排在第3位［1］。手術為肝癌目前最好的治療手段，但由于肝癌起病隱匿，多數患者就診時已為中期甚至晚期，無法行根治性手術，通過介入等治療方法一定程度上提高了療效，但總體效果仍欠佳［2］。對晚期肝癌患者，靶向藥物索拉菲尼等的出現，使晚期肝癌的治療出現了明顯改善。接受索拉非尼治療的患者的中位生存期約為10.7個月，較接受安慰劑的患者延長近3個月。但索拉非尼組的腹瀉、體質量減輕、手足皮膚反應和低磷血癥更常見［3］。對免疫療法的反應或原發耐藥的生物標志物的研究也在推進［4］。為了進一步提高肝癌的療效，針對早期肝癌的診斷指標及治療靶標研究顯得尤為重要。ATP6V1C1基因編碼是液泡ATP酶（V?ATPase）的一種成分，是一種多亞基酶，可介導真核細胞的細胞內區室的酸化。V?ATPase依賴性酸化對于蛋白質分選、酶原激活、受體介導的內吞作用和突觸囊泡質子梯度生成等細胞內過程是必需的。目前在乳腺癌、口腔癌、食管癌的研究均提示ATP6V1C1可以促進腫瘤發生發展，但ATP6V1C1在肝癌方面的研究仍未見報道［5?10］。因此本研究通過分析數據庫ATP6V1C1正常肝組織與腫瘤組織的相對表達量，以其為HCC提供了新的可能診斷及治療靶標。

資料與方法

1、生物信息學分析

1.1、癌癥基因組圖譜數據庫（GEO）數據庫分析從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GSE121248、GSE14520、GSE36376、GSE62232、GSE74656，利用GEO2R分析各個芯片數據的差異表達基因（differentially expressed genes，DEG），篩選條件為P＜0.01、|logFc|≥1，共得出上調基因34個、下調基因37個。其中ATP6V1C1在以上數據集均明顯上調（圖1、表1），這引起我們進一步的研究興趣，我們假設其高表達與肝癌患者預后相關，于是進一步分析癌癥基因組圖譜（TCGA）相關數據庫。

圖1 GEO2R分析GSE121248、GSE14520、GSE36376、GSE62232、GSE74656共同差異基因71個，其中上調34個、下調37個

1.2、UALCAN數據庫分析 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）提供對公開可用的癌癥OMICS數據（TCGA、MET500和CPTAC），是一個用于分析癌癥數據庫，提供描繪蛋白質編碼、miRNA編碼和lincRNA編碼基因的表達譜和患者存活信息［11］。在基于腫瘤分級和分期、患者年齡、性別、種族和體質量的亞組分析中，LIHC中ATP6V1C1的表達顯著高于正常組織，并與臨床分期相關，高表達組預后更差（P＜0.05）（圖2）。

1.3、TIMER數據庫分析 TIMER是系統分析不同癌癥類型免疫浸潤的綜合資源（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）［12］。TIMER數據庫包括來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的32種癌癥類型的10 897份樣本，可估計基因在腫瘤與正常組織差異基因表達。分析結果顯示膀胱移行上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、結腸癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗癌、直腸腺癌、胃食管癌均正常組織均明顯表達上調（圖3）。

1.4、The Human Protein Atlas數據庫分析 The Human Protein Atlas數據庫（https：//www.proteinatlas.org/）旨在利用各種組學技術的集成繪制細胞、組織和器官中的所有人類蛋白質，包括基于抗體的成像、基于質譜的蛋白質組學、轉錄組學和系統生物學。數據庫示ATP6V1C1在正常組織和肝癌組織表達情況，正常肝組織了3例患者均未檢測到表達，檢測表達比例為0%（0/3）。腫瘤組織12例，4例檢測中等表達、4例檢測低表達、4例未檢測到表達，檢測表達比例為33.3%（4/12）（圖4）。

表1 芯片數據集上調及下調基因

圖2 ATP6V1C1在肝細胞癌不同分期、分化、種族、年齡、性別、體質量與正常肝組織的比較

圖3 來自癌癥基因組圖譜數據庫的不同腫瘤類型中的ATP6V1C1表達水平

1.5、KEGG信號通路分析 KEGG（http：//www.kegg.jp/）是基因和基因組的百科全書［13］。在分子和更高水平上為基因和基因組分配功能意義是KEGG數據庫項目的主要目標。經過查閱KEGG，發現ATP6V1C1在mTOR通路可激活Ragulator復合物的形成，從而激活RasA/B/C/D，最終促進MTORC1表達。MTORC1的磷酸化抑制ATG1，然后參與到自噬相關的調控［14］。自噬在癌癥發展的不同背景和階段中起著動態的腫瘤抑制或腫瘤促進作用。在腫瘤的早期，可能防止腫瘤發生并抑制癌癥進展。一旦腫瘤進展到晚期并建立并受到環境壓力，自噬可促進腫瘤轉移來促進癌癥的侵襲性，甚至增加腫瘤的化學抗性［15?16］。另外MTORC1可磷酸化激活S6K，參與到P13K?AKT負反饋調控（圖5）。

2、體外細胞實驗了解ATP6V1C1過表達及干擾對肝癌細胞的生物學功能影響

細胞孵育箱條件：溫度37℃、5%CO2，完全培養基為90%改良依格爾（DMEM）（美國，Gibco）加10%胎牛血清（美國，Gibco），1%青霉素?鏈霉素（美國，Invitrogen）。

細胞轉染：對照組NC質粒為pcDNA3.1（+），目的過表達質粒自己構建，pcDNA3.1（+）?ATP6V1C1，使 用Lipofectamine2000（美國，Invitrogen）在說明書的指導下進行。轉染前使用無血清培養基進行培養，轉染后6 h換成完全培養基培養，保證轉染效率。

細胞干擾：小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）參考并從吉瑪公司（中國）購買，靶向序列5′?CAATGCTACTTCAGCCCAA?3′，使用Lipofectamine RNAiMAX（美國，Invitrogen），在說明書的指導下進行［17］。干擾前使用無血清培養基進行培養，干擾后6 h換成10%培養基培養，保證干擾效率。

3、Western blot、Transwell、增殖及平板集落形成實驗均采用過表達或干擾48 h的細胞樣品

Western blot實驗：細胞樣本PBS洗滌后，使用添加PMSF蛋白酶抑制劑的Western及IP細胞裂解液（中國，碧云天）冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，通過SDS?PAGE凝膠電泳分離總蛋白，轉移到聚偏二氟乙烯膜（美國，Millipore）上，5%牛奶封閉2 h，在4℃條件下一抗（中國，Proteintech）孵育14～16 h（ATP6V1C1 1∶1 000，β?actin 1∶4 000），然后在37℃二抗孵育2 h，化學顯色后檢測相關蛋白的表達。

圖4 The Human Protein Atlas示正常肝組織（A）與腫瘤組織（B）免疫組化染色檢測ATP6V1C1蛋白表達情況（鏡下標尺20μm，10×10倍）

圖5 ATP6V1C1對mTOR信號通路的作用

Transwell實驗：侵襲實驗，將基質膠（美國，Corning）按1∶7比例與無血清培養基冰上混勻，取40μl平鋪于Transwell腔室，置入孵育箱1 h凝固。將200μl包含1.5×105個細胞的細胞懸液均勻鋪展到孔徑為8μm的24孔Transwell腔室（美國，Corning），下腔室添加完全培養基，孵育48 h后，PBS洗滌，甲醇室溫固定15 min，0.7%結晶紫染色5 min，棉簽輕拭去未遷移至下室的細胞，在顯微鏡10×10拍照后用Image J軟件統計遷移的細胞數量。遷移實驗不鋪基質膠，余步驟同侵襲，收集小室時間為24 h。

增殖實驗：消化后完全培養基重懸細胞，將含1×104個細胞的1 ml細胞懸液接種于24孔板，設3個復孔，共5 d，連續記錄每組細胞生長數，繪制生長曲線。

平板集落形成實驗：細胞消化完全培養基重懸后取500個細胞的懸液均勻接種于含4 ml 10%培養基的6孔板中，并設3個復孔。培養箱中培養10～14 d，單克隆的細胞集落約含50個細胞并肉眼可見時終止培養，吸掉培養基，PBS洗滌，甲醇固定15～30 min，1%1 ml結晶紫室溫染色15 min，洗去多余染色液，干燥后拍照，Image J軟件統計集落數目。

4、統計學方法

使用統計軟件SPSS26（美國，IBM）進行統計分析，除特殊說明外，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，使用GraphPad Prism8.0軟件進行數據的統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、過表達ATP6V1C1后檢測HepG2細胞前后的功能改變

過表達ATP6V1C1后Western blot檢測ATP6V1C1蛋白增多，肝癌細胞HepG2侵襲、遷移、增殖及平板集落形成能力增強（圖6）。

2、干擾ATP6V1C1后檢測HepG2細胞前后的功能改變

干擾TP6V1C1后Western blot檢測ATP6V1C1蛋白減少，肝癌細胞HepG2侵襲、遷移、增殖及平板集落形成能力減弱（圖7）。

討 論

肝癌在全球發病率中位于第7位，病死率為第3位，其早期診斷方法較少，治療效果有限，患者預后較差。因此，探究肝癌的發病分子機制，有助于尋找肝癌的早期診斷標志物和有效治療靶點，對提高患者生存率及時間有重要意義。

活化的肝星狀細胞在肝纖維化中起關鍵作用，我們都知道肝纖維化與病毒性肝炎、長期酗酒等有關，未經治療的病毒性肝炎、肝纖維化被認為是肝癌主要病因［17］。而敲低ATP6V1C1可一定程度延緩肝纖維化［18］。ATP6V1C1是V?ATPase的一個亞基，與其他亞基相比，ATP6V1C1是口腔鱗狀細胞癌中上調明顯的基因，可影響單個細胞內的pH值，它被認為控制著腫瘤的生長和轉移［6?8］。它在牙髓疾病的破骨細胞明顯升高，它的過表達可促進破骨細胞的作用，敲低ATP6V1C1減緩了牙髓疾病的進展，防止了骨侵蝕，并可能通過調節TLR信號來減輕根尖周組織和牙周韌帶的炎癥［16，19?20］。ATP6V1C1在乳腺癌轉移中起著關鍵作用，ATP6V1C1敲低降低了癌細胞的細胞增殖并損害了mTORC1通路的激活［5］。磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物西羅莫司靶蛋白（mTOR）信號通路在肝癌組織中存在過度表達，這可能是肝癌發生、進展及轉移的一個機制，可能是肝癌防治的一個新靶點［21］。同時有研究表明，ATP6V1C1的高表達會影響乳腺癌細胞的肌動蛋白結構，從而促進乳腺癌轉移［22］。另外在食管癌的研究提示ATP6V1C1抑制自噬并增強食管鱗狀細胞癌的放療抗性［10］。

圖6 過表達ATP6V1C1后檢測HepG2細胞前后的功能改變

圖7 干擾ATP6V1C1后檢測HepG2細胞前后的功能改變

在這項研究中，我們通過生物信息學分析發現了ATP6V1C1在肝癌組織中明顯上調，并發現其與患者預后相關，體外細胞過表達或干擾ATP6V1C1能明顯改變肝癌細胞的生物學功能，為肝癌獨立預測因素。根據文獻閱讀提示ATP6V1C1可能與mTOR信號通路相關，并影響自噬從而導致影響腫瘤生長。后續研究需要新鮮病理組織進一步驗證是否與TCGA肝癌表達一致，進一步探索其對肝癌細胞株功能改變的分子機制，同時構建穩定過表達及敲除ATP6V1C1細胞株檢測小鼠原位成瘤及轉移模型進一步評估。

我們發現ATP6V1C1在肝癌組織中上調，其過表達可促進肝癌細胞侵襲、遷移、增殖及克隆形成能力，相反，干擾該基因可導致以上功能下降。這些結果提示，ATP6V1C1可能在肝癌的發生發展過程中起到重要作用，并有發展為肝癌的診斷及靶向治療藥物的潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突